Aqui descrevemos um protocolo para a geração de nanoliposomes catiônico, o qual se baseia o método seco-filme e pode ser usado para o cofre e entrega eficiente do in vitro transcrito de RNA mensageiro.
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Artigo de método
Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento do RNA mensageiro (mRNA)-com base em terapêutica para o tratamento de várias doenças se torna cada vez mais importante devido o positivo Propriedades in vitro transcrito (IVT) mRNA. Com a ajuda de IVT mRNA, a síntese de novo de uma proteína desejada pode ser induzida sem alterar o estado fisiológico da célula alvo. Além disso, a biossíntese de proteínas pode ser controlada precisamente devido ao efeito transiente de mRNA IVT.
Para a eficiente transfecção de células, nanoliposomes (NLps) pode representar um veículo de entrega segura e eficiente para a terapêutica do mRNA. Este estudo descreve um protocolo para gerar segura e eficiente catiônica NLps consistindo de DC-colesterol e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como um vetor de entrega para IVT mRNA. NLps tendo um definido tamanho, uma distribuição homogénea e uma capacidade de complexação de alta e pode ser produzidos usando o método seco-filme. Além disso, apresentamos os sistemas de teste diferente para analisar sua complexação e eficácias de transfeccao usando sintética reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, bem como seus efeitos sobre a viabilidade celular. No geral, o protocolo apresentado fornece uma abordagem eficaz e segura para complexação de mRNA, que pode avançar e melhorar a administração de terapêutica mRNA.
Introdução
O uso de mRNA modificados para aplicações terapêuticas tem mostrado grande potencial no último par de anos. Em doenças cardiovasculares, inflamatórias e eurogenética, bem como no desenvolvimento de vacinas, o mRNA é um promissor agente terapêutico1.
Terapia de reposição de proteína com mRNA oferece diversas vantagens sobre a terapia de gene clássica, que se baseia a transfeccao de ADN em células alvo2. A função do mRNA inicia diretamente no citosol. Embora o plasmídeo de DNA (pDNA), uma construção de dupla-hélice, circular DNA contendo uma região promotora e uma sequência de genes codificação ....
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Protocolo
1. geração de Nanoliposomes catiônica (Figura 1)
- Dissolva os lipídios DC-colesterol (3beta-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil] colesterol cloridrato) e drogas (fosfatidiletanolamina dioleoyl), fornecido como um pó, em clorofórmio para obter uma concentração final de 25 mg/mL.
Nota: Guarde os lipídios dissolvidos em-20 ° C. - Trabalhar com 25 mg/mL de solução de ambos os lipídios. Mix de 40 µ l do DC-colesterol dissolvido e 80 µ l da droga dissolvida em um balão de vidro.
Nota: A quantidade de lipídios totais é de 3 mg. Para evitar a rápida evaporação do clorofórmio, coloque os lipídios no gelo durante a pipet....
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Resultados
Usando o protocolo como descrito, NLps consistindo de lipídeos DC-colesterol e droga foram preparadas usando o método seco-filme (Figura 1). Durante a preparação, a solução de nanoliposome mostra diferentes fases na turbidez (Figura 2).
A eficácia de encapsulamento do NLps pode ser analisada após o encapsulamento de 1 µ g de mRNA eGFP-codificação, analisando a quantidad.......
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Discussão
O protocolo apresentado descreve a geração de NLps com eficácia elevada de encapsulamento para mRNA sinteticamente modificado, assim como o transfection confiável de células em vitro. Além disso, os NLps garantir a liberação do mRNA, que por sua vez, é traduzida em uma proteína funcional no interior das células. Além disso, os transfections usando NLps podem ser executadas no meio celular regular, resultando em alta realidades da pilha durante a transfeccao, e durar até três dias depois do transfection.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Broridrato de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Alemanha | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimetilaminoetano)-carbamoil]cloridrato de colesterol (DC-Colesterol) | Avanti, Alabama, EUA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 340181 | |
| Clorofórmio | Merck, Darmstadt, Alemanha | 102445 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha | 20385.02 | |
| Dioleoyl fosfatidiletanolamina (DOPE) | Avanti, Alabama, EUA | 850725 | |
| Microscópio de fluorescência | Zeiss Axio, Oberkochen, Alemanha | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | 11668019 | |
| Mini extrusora | Avanti, Alabama, EUA | ||
| Água livre de nuclease | Qiagen, Hilden, Alemanha | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | 11058021 | |
| Tampão PBS (sem Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | 70011044 | |
| Kit de reagentes de RNA Quant-iT Ribo Green Thermo | Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | Q33140 | |
| RPMI (sem vermelho de fenol) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | 11835030 | |
| Gel de sílica | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | P077 | |
| Tripsina/EDTA (0,05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | 25300054 | |
| Kit de polimerase HotStar HiFidelity | Qiagen, Hilden, Alemanha | 202602 | |
| Kit de purificação de PCR QIAquick | Qiagen, Hilden, Alemanha | 28104 | |
pseudouridina-5'-trifosfato (ψ-UTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, EUA | N-1019 | |
| 5-metilcitidina-5'-trifosfato (metil-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, EUA | N-1014 | |
| Cianina 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Alemanha | ||
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Alemanha | 74104 | |
| Kit de Transcrição MEGAscript T7 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | AM1333 | |
| 3&agudo;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analógico | New England Biolabs, Ipswich, EUA | S1411L | |
| Fosfatase Antártica | Novo England Biolabs, Ipswich, EUA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, EUA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pensilvânia, EUA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Gö teborg, Suécia | 11528766 |
Referências
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., King....
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Reimpressões e permissões
