वीवो में एक Murine घाव मॉडल में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की इमेजिंग
Summary
हम एक गैर-इनवेसिव vivo इमेजिंग प्रोटोकॉल है कि सुव्यवस्थित और लागत प्रभावी है का वर्णन, एल 012 का उपयोग, एक chemiluminescent luminol-एनालॉग, कल्पना और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) एक माउस excisional घाव मॉडल में उत्पन्न करता है ।
Abstract
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के उत्पादन भड़काऊ प्रक्रियाओं की एक बानगी है, लेकिन अतिरिक्त में, ऑक्सीडेटिव तनाव व्यापक रूप से कैंसर, atherosclerosis और मधुमेह जैसे विभिन्न विकृतियों में फंसा है । हम पहले से पता चला है कि परमाणु कारक की शिथिलता (erythroid-2 व्युत्पंन)-2 की तरह (Nrf2)/Kelch-जैसे erythroid कोशिका-1 प्रोटीन व्युत्पंन (Keap1) संकेतन मार्ग मधुमेह में त्वचा के घाव भरने के दौरान चरम ROS असंतुलन की ओर जाता है । चूंकि ROS स्तर घाव भरने की प्रगति का एक महत्वपूर्ण संकेतक हैं, विशिष्ट और सटीक ठहराव तकनीक मूल्यवान हैं । कई इन विट्रो में कोशिकाओं और ऊतकों में ROS को मापने के लिए परख वर्णित किया गया है; हालांकि, वे केवल प्रति नमूना एक संचई माप प्रदान करते हैं । हाल ही में, प्रोटीन के विकास आधारित संकेतकों और इमेजिंग मोडलों अद्वितीय spatiotemporal विश्लेषण के लिए अनुमति दी है । L-012 (सी13ज8ClN4नाव2) एक luminol व्युत्पंन है कि दोनों vivo में और इन विट्रो chemiluminescent NAPDH oxidase द्वारा उत्पंन ROS का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एल 012 अंय फ्लोरोसेंट जांच की तुलना में एक मजबूत संकेत उत्सर्जन करता है और ROS का पता लगाने के लिए दोनों संवेदनशील और विश्वसनीय होना दिखाया गया है । एल के समय चूक प्रयोज्य-012-सुविधा इमेजिंग भड़काऊ प्रक्रियाओं के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है, जबकि बलिदान के लिए जरूरत को कम करने और समग्र अध्ययन पशुओं की संख्या को कम करने । यहां, हम का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन एक एल-012- vivo इमेजिंग में सुविधा के लिए excisional घाव चिकित्सा के एक मॉडल में ऑक्सीडेटिव तनाव यों तो स्थानीय रूप से बेकार Nrf2 के साथ मधुमेह चूहों का उपयोग/Keap1 ।
Introduction
भड़काऊ प्रक्रियाओं के माध्यम से उत्पन्न ऑक्सीजन चयापचयों विभिन्न संकेतन झरने के साथ ही सेलुलर घटक1के विनाशकारी परिवर्तन करने के लिए योगदान । ROS को मापने के लिए संवेदनशील और विशिष्ट तकनीकों का उपयोग भड़काऊ प्रक्रियाओं का अध्ययन करने और ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव निस्र्पक के लिए महत्वपूर्ण है । vivo इमेजिंग में अपने जीवित ऊतक में गतिशील स्थानिक और लौकिक डेटा प्रदान करने की क्षमता की वजह से मूल्यवान है । L-012 एक सिंथेटिक chemiluminescent जांच है कि सुपरऑक्साइड ॠणायन के लिए अत्यधिक संवेदनशील है और कोशिकाओं, ऊतकों में अन्य फ्लोरोसेंट जांच की तुलना में एक उच्च प्रकाश तीव्रता का उत्पादन है, और पूरे रक्त1,2,3, 4. यह सफलतापूर्वक murine मॉडल में vivo इमेजिंग में गठिया और कोलाइटिस5,6सहित कई भड़काऊ रोगों का अध्ययन करने के लिए, के लिए कार्यरत किया गया है । यह अभी तक एक की स्थापना की त्वचा के घाव भरने मॉडल में कार्यरत है । ROS उत्पन्न की माप विभिन्न स्थितियों के तहत घाव भरने की प्रगति का आकलन करने के लिए समान रूप से प्रासंगिक है । इस विधि की संवेदनशीलता और इनवेसिव प्रकृति यह murine मॉडल भर में घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक होनहार तकनीक बनाता है ।
Nrf2 एंटीऑक्सिडेंट प्रतिक्रिया के एक प्रमुख चालक और एंटीऑक्सीडेंट प्रतिक्रिया तत्व के लिए विशिष्टता के साथ एक transcriptional कारक है (कर रहे हैं) कई एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों8के प्रवर्तक क्षेत्रों के लिए आम है । ऑक्सीडेटिव तनाव के अभाव में Nrf2 Keap1 द्वारा कोशिका द्रव्य में तनहा है, जो बाद में इसके ubiquitination और क्षरण का कारण बनता है । Nrf2/Keap1 मार्ग के असंतुलन अनुचित redox homeostasis में फंसाया गया है और बढ़ी हुई ऑक्सीडेटिव तनाव9की सेटिंग में घाव भरने में देरी । हम पहले से पता चला है कि Keap1 के दमन वृद्धि हुई Nrf2 गतिविधि को उत्तेजित करता है और रोग के बचाव को बढ़ावा देता है मधुमेह घावों में घाव भरने की त्वचा घाव9।
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि एल-012-असिस्टेड bioluminescence इमेजिंग एक excisional त्वचा के घाव भरने मॉडल है, जो ROS और घाव भरने के बीच सहयोग पर प्रकाश डाला के लिए महत्वपूर्ण है में ROS स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल करता है । यह तकनीक घाव और तत्काल परिधि के भीतर ऑक्सीडेटिव बोझ में वास्तविक समय परिवर्तन को दर्शाता है । इसके अलावा, इस विधि के हस्तक्षेप और तंत्र है कि redox हैंडलिंग को प्रभावित के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । यहां हम redox homeostasis की बहाली के लिए Keap1 पछाड़ना के एक मॉडल का उपयोग करने के लिए हमारी रणनीति की प्रयोज्यता का मूल्यांकन । क्योंकि हमारी तकनीक गैर इनवेसिव है और घाव परेशान कर रहे हैं, एक ही जानवर प्रोटोकॉल या कोशिका lysates के आधार पर आगे पुष्टि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ROS मापने के लिए आम तकनीक जटिल ऊतक निष्कर्षण या इसी तरह इनवेसिव तकनीक की आवश्यकता प्रोटोकॉल द्वारा सीमित किया गया है । हाल के वर्षों में, ऑक्सीडेटिव तनाव की माप अभिनव इमेजिंग विधियों के आधार पर सूचित किय?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम NYU स्कूल ऑफ मेडिसिन में, ऑरलैंडो Aristizabal और Youssef Zaim Wadghiri के लिए विशेष धंयवाद के साथ नैदानिक इमेजिंग कोर के लिए आभारी हैं । कोर एक साझा संसाधन आंशिक रूप से लौरा और इसहाक Perlmutter कैंसर केंद्र सहायता अनुदान NIH/NCI 5P30CA016087 और NIBIB जैव प्रौद्योगिकी संसाधन केंद्र अनुदान NIH P41 EB017183 द्वारा समर्थित है । यह काम अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था “मधुमेह रोकने के लिए मार्ग” डीसी को [अनुदान संख्या 1-16-इक्का-08] और NYU एप्लाइड अनुसंधान सहायता कोष के लिए P.R.
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
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