In Vivo Beeldvorming van reactieve zuurstof soorten in een RattenUitrustingen wond Model
Summary
Een niet-invasieve in vivo imaging protocol dat is gestroomlijnd en kosteneffectieve, beschrijven we met behulp van L-012, een chemiluminescentie luminol-analoog, om te visualiseren en te kwantificeren van reactieve zuurstof soorten (ROS) gegenereerd in een excisional wond muismodel.
Abstract
De generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) is een kenmerk van inflammatoire processen, maar in overmaat, oxidatieve stress is sterk betrokken bij verschillende ziektebeelden zoals kanker, atherosclerose en diabetes. Wij hebben eerder getoond dat disfunctie van de nucleaire factor (erythroid afkomstige 2)-2 (Nrf2) leuk / Kelch-achtige erythroid cel afkomstige eiwit 1 (Keap1) signalering traject leidt tot extreme ROS onbalans tijdens cutane wondgenezing bij diabetes. Aangezien ROS niveaus een belangrijke indicator voor voortgang zijn van wondgenezing, zijn specifieke en nauwkeurige kwantificering technieken waardevol. Verscheidene in vitro tests voor het meten van ROS in cellen en weefsels zijn beschreven; Zij bieden echter slechts een enkele cumulatieve meting per monster. Meer recentelijk hebben de ontwikkeling van indicatoren op basis van eiwitten en beeldvormende modaliteiten toegestaan voor unieke Spatio analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is een derivaat van luminol dat kan worden gebruikt voor zowel in vivo pt in vitro chemiluminescentie detectie van ROS gegenereerd door NAPDH-oxidase. L-012 stoot een sterker signaal dan andere tl sondes en heeft aangetoond dat zowel gevoelige en betrouwbare voor het opsporen van ROS. De tijd vervallen toepasselijkheid van L-012-vergemakkelijkt imaging biedt waardevolle informatie over inflammatoire processen terwijl het verminderen van de noodzaak van offer en over het algemeen het aantal studie dieren te verminderen. Hier beschrijven we een protocol met behulp van L-012-vergemakkelijkt in vivo imaging om te kwantificeren oxidatieve stress in een model van excisional wondgenezing met behulp van diabetesmuizen met lokaal disfunctionele Nrf2/Keap1.
Introduction
Zuurstof metabolieten gegenereerd door inflammatoire processen dragen bij aan verschillende signalering cascades evenals destructieve wijziging van cellulaire componenten1. Met behulp van gevoelige en specifieke technieken voor het meten van de ROS is essentieel voor het bestuderen van inflammatoire processen en karakteriseren van de effecten van oxidatieve stress. In vivo imaging is waardevol vanwege de mogelijkheid om dynamische ruimtelijke en temporele gegevens in levend weefsel te verstrekken. L-012 is een synthetische chemiluminescentie sonde die is zeer gevoelig voor superoxide anionen en produceert een hogere lichtintensiteit dan andere tl sondes in cellen, weefsels en bloed1,2,3, 4. het heeft met succes gewerkt voor in vivo imaging in lymfkliertest modellen te bestuderen van de verschillende ontstekingsziekten, met inbegrip van artritis en colitis5,6. Het moet nog worden ingezet in een gevestigde cutane wond genezing model. Meting van ROS gegenereerd is even relevant zijn voor het beoordelen van de voortgang van de wondgenezing onder verschillende omstandigheden. De gevoeligheid en de noninvasive aard van deze methode maakt het een veelbelovende techniek voor het bestuderen van de wondgenezing lymfkliertest modellen.
Nrf2 is een belangrijke motor van de antioxidant-respons en een transcriptionele factor met specificiteit voor de antioxidant respons-element (ARE) gemeenschappelijk aan de promotor gebieden van verschillende antioxidant enzymen8. Bij het ontbreken van oxidatieve stress, is Nrf2 afgezonderd in het cytoplasma door Keap1, waardoor vervolgens haar ubiquitination en afbraak. Onbalans van de Nrf2/Keap1-traject heeft betrokken bij ongepast redox homeostase en vertraagde wondgenezing in de omgeving van verhoogde oxidatieve stress9. Wij hebben eerder aangetoond dat de onderdrukking van de Keap1 verhoogde Nrf2 activiteit stimuleert en bevordert redding van pathologische cutane wondgenezing in diabetische wonden9.
Hier beschrijven we een protocol dat gebruikmaakt van L-012-bijgewoonde bioluminescentie imaging voor het meten van ROS niveaus in een excisional cutane wond genezing model, dat is van cruciaal belang voor het benadrukken van de associatie tussen ROS en wondgenezing. Deze techniek toont real-time wijzigingen in oxidatieve belasting binnen wonden en onmiddellijke periferie. Voorts staat deze methode voor snelle evaluatie van interventies en mechanismen die invloed redox behandeling. Hier gebruiken we een model van Keap1 knockdown voor het herstel van de redox homeostase te evalueren van de toepasbaarheid van onze strategie. Omdat onze techniek niet-invasief is en wonden ongestoord zijn, kan hetzelfde dier worden gebruikt voor verdere bevestigende analyses op basis van histologie of cel lysates.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gemeenschappelijke technieken voor het meten van ROS hebben beperkt gebleven door complexe protocollen waarvoor weefsel extractie of vergelijkbare invasieve technieken. In de afgelopen jaren zijn de metingen van oxidatieve stress gemeld op basis van innovatieve beeldvormende modaliteiten, waardoor voor Spatio evaluaties9,10,11. L-012 heeft een aantal voordelen als een chemiluminescentie sonde ten opzichte van luminol, lucigenin …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan de preklinische Imaging Core aan de NYU School of Medicine, met speciale dank aan Orlando Aristizabal en Youssef Zaim Wadghiri. De kern is een gedeelde bron slechts gedeeltelijk ondersteund door de Laura en Isaac Perlmutter Cancer Center ondersteuning Grant NIH/NCI 5P30CA016087 en NIBIB biomedische technologie Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Dit werk werd gesteund door de American Diabetes Association “Traject te stoppen-Diabetes” D.C. [subsidie nummer 1-16-ACE-08] en de NYU toegepast onderzoek Steunfonds aan P.R.
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
Referências
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
