Mikrodalyse af excitatoriske aminosyrer under EEG optagelser i frit flytte rotter

Summary

Her, beskriver vi en metode til i vivo mikrodalyse til at analysere aspartat og glutamat udgivelse i den ventrale hippocampus epileptiske og ikke-epileptiske rotter i kombination med EEG optagelser. Ekstracellulære koncentrationer af aspartat og glutamat kan være korreleret med de forskellige faser af sygdommen.

Abstract

Mikrodalyse er en veletableret neurovidenskab teknik, der korrelerer ændringer af neurologisk lægemiddelstoffer spreder ind i hjernen interstitielle rum med adfærd og/eller specifikke resultatet af en patologi (fx anfald for epilepsi). Når man studerer epilepsi, er den mikrodalyse teknik ofte kombineret med kortsigtede eller endda langsigtede video-electroencefalografi (EEG) overvågning for at vurdere spontane anfald hyppigheden, sværhedsgrad, progression og klyngedannelse. Den kombinerede mikrodalyse-EEG er baseret på brug af flere metoder og instrumenter. Her, udførte vi i vivo mikrodalyse og kontinuerlig video-EEG optagelse til skærm glutamat og aspartat udstrømning over tid, i forskellige faser af den naturlige historie af epilepsi i en rotte model. Dette kombinerede tiltag giver mulighed for parring af ændringer i neurotransmitter frigivelse med bestemte faser af udvikling af sygdom og progression. Koncentrationen af aminosyren i den dialysat var bestemt af væskekromatografi. Her, vi beskrive metoder og skitsere de vigtigste forebyggende foranstaltninger man skal tage under i vivo mikrodalyse-EEG, med særlig vægt på de stereotaxisk kirurgi, basal og høj kalium stimulering under mikrodalyse, dybde elektrode EEG registrering og højtydende væskekromatografi analyse af aspartat og glutamat i den dialysat. Denne tilgang kan tilpasses til at teste forskellige stof eller sygdom induceret ændringer af de fysiologiske koncentrationer af aspartat og glutamat i hjernen. Afhængigt af tilgængeligheden af en passende analytisk assay, kan det yderligere bruges til at teste forskellige opløselige molekyler, når ansætte EEG optagelse på samme tid.

Introduction

For at give indsigt i den funktionelle svækkelse af glutamat-medieret excitatoriske og GABAergic hæmmende neurotransmission resulterer i spontane anfald i FLE (TLE) har overvåges vi systematisk ekstracellulære koncentrationer af GABA¹ og senere niveauer af glutamat og aspartat² af mikrodalyse i den ventrale hippocampus af rotter på forskellige tidspunkter af sygdommens naturlige kursus, dvs, i løbet af udvikling og progression af epilepsi. Vi tog fordel af TLE pilocarpin model i rotter, som efterligner sygdom meget præcist med hensyn til adfærdsmæssige, elektrofysiologiske og histopatologiske forandringer^3,4 og vi korreleret dialysat koncentrationen af amino syrer til sine forskellige faser: den akutte fase efter den epileptogenic fornærmelse, latency fase, tidspunktet for den første spontane anfald og kronisk phass^5,6,7. Indramning sygdom faser blev aktiveret af video-EEG langtidsovervågning og præcise EEG og klinisk karakterisering af spontane anfald. Anvendelsen af mikrodalyse teknik forbundet med langsigtede video-EEG overvågning tilladt os at foreslå mekanistiske hypoteser for TLE neuropatologiske. I Resumé tillader teknikken beskrevet i dette håndskrift bindingen af neurokemiske forandringer inden for et defineret hjernen område med udvikling og progression af epilepsi i en dyremodel.

Forbundne enheder, der består af en dybde elektrode sammenstillet til en mikrodalyse kanyle, er ofte beskæftiget i epilepsi forskningsundersøgelser hvor ændringer i neurotransmittere, deres metabolitter eller energi substrater bør være korreleret til neuronal aktivitet. I langt de fleste tilfælde, det bruges i frit opfører dyr, men det også kan gennemføres på samme måde i mennesker, fxi farmako-resistente epileptiske patienter i dybde elektrode undersøgelse før kirurgi⁸. Både EEG registrering og dialysat samling kan udføres særskilt (f.eks.implantering elektrode i en halvkugle og mikrodalyse sonde i anden halvkugle eller selv udføre mikrodalyse i én gruppe af dyr, mens de udfører den eneste EEG i en anden gruppe af dyr). Dog kobling elektroder til sonder kan have flere fordele: det forenkler stereotaxisk kirurgi, begrænser vævsskader til kun én halvkugle (mens den anden intakt, som et kontrolelement for histologiske undersøgelser), og homogenizes resultater som disse er fremstillet af det samme område af hjernen og de samme dyr.

På den anden side kræver forberedelse af koblede mikrodalyse sonde-elektrode enhed færdigheder og tid, hvis det er hjemmelavet. Man kunne bruge relativt store mængder af penge, hvis købt fra markedet. Desuden, hvornår mikrodalyse sonder (sonde tips er typisk 200-400 µm i diameter og 7-12 mm lange)⁹og EEG elektroder (elektrode tips er normalt af 300-500 µm i diameter, og lang nok til at nå den hjerne struktur af interesse¹⁰) kombineret, repræsenterer de monterede enhed en pladskrævende og relativt tunge objekt på den ene side af hovedet, som er besværlige for dyr og tilbøjelige til at være tabt, især når det er tilsluttet til dialyse pumpen og hårdt-wire EEG optagelse system. Dette aspekt er mere relevante i epileptiske dyr, der er svære at håndtere og mindre adaptive til mikrodalyse sessioner. Korrekte kirurgiske teknikker og passende postoperativ pleje kan resultere i langvarig implantater, der forårsager minimal animalske ubehag og bør videreføres for combinatory mikrodalyse-EEG eksperimenter^{10,11, 12}.

Fordele og begrænsninger af den mikrodalyse teknik er blevet behandlet i detaljer af mange neuroforskere. Dens primære fordel over andre i vivo perfusion teknikker (f.eks., hurtigt flow push-pull eller kortikale cup perfusion) er en lille diameter af sonden, der dækker et relativt præcise område af interesse^{13,14, 15}. For det andet skaber den mikrodalyse membran en fysisk barriere mellem væv og perfusate; derfor høj Molekylær vægt stoffer krydse ikke og forstyrrer ikke analysen^16,17. Desuden, væv er beskyttet fra turbulent strømning af perfusate¹⁸. En anden vigtig fordel er muligheden for at ændre perfusate strømmen for at maksimere analysandens koncentration i perfusate (dvs., processen med mikrodalyse godt kan defineres matematisk og kan ændres til at give høj koncentrationer af analysand i prøveopløsningen)¹⁹. Endelig, teknikken kan bruges til at indgyde stoffer eller restkoncentrationer af farmakologisk virksomme stoffer i væv af interesse og bestemme deres virkning i stedet for intervention²⁰. På den anden side har mikrodalyse en begrænset løsningstid (typisk mere end 1 min på grund af den nødvendige tid til indsamling af prøver) i forhold til elektrokemisk eller biologiske sensorer; Det er en invasiv teknik, der forårsager vævsskader; Det bringer den neurokemiske balance i rummet omkring membran på grund af den fortsatte koncentration graduering af alle opløselige stoffer, der træder perfusate sammen med analysanden af interesse. Endelig, den mikrodalyse teknik er stærkt påvirket af grænserne for de analytiske teknikker anvendes til kvantificering af stoffer i perfusate^9,21,22,23 . High-performance væskekromatografi (HPLC) efter forædling med orthophthaldialdehyde for glutamat og aspartat analyse i biologiske prøver er blevet godt valideret^{24,25,26 , 27} og dens omfattende diskussion er ikke omfattet af dette manuskript, men de data, der er produceret ved hjælp af denne metode vil blive beskrevet i detaljer.

Når udført korrekt og uden ændringer af perfusate sammensætning, kan mikrodalyse give pålidelige oplysninger om de basale niveauer af neurotransmitter frigivelse. Den største del af de basale niveauer er sandsynligvis et resultat af senderen afsmitning fra synapser⁹. Fordi i mange tilfælde enkel prøveudtagning af neurotransmitter i det ekstra synaptic rum ikke er tilstrækkelige til at forfølge målene i en undersøgelse, kan mikrodalyse teknik anvendes også, at stimulere neuroner eller at fratage dem vigtige fysiologiske ioner som K⁺ eller Ca^{2 +}, at fremmane eller forhindre frigivelse af neurotransmitter.

Høj K⁺ stimulation er ofte brugt i neurobiologi for at stimulere neuronal aktivitet ikke blot i vågen dyr, men også i grundskolen og organotypic kulturer. Udsættelse af en sund centralnervesystemet til løsninger med høje koncentrationer af K⁺ (40-100 mM) fremkalder udstrømningen af neurotransmittere²⁸. Denne evne af neuroner til at give en yderligere frigivelse i svar til høj K⁺ kan blive kompromitteret i epileptiske dyr¹ og andre neurodegenerative sygdomme^29,30. Ligeledes frigive Ca^{2 +} afsavn (fremstillet ved perfusing Ca^{2 +} gratis løsninger) bruges til at etablere calcium-afhængige af de fleste neurotransmittere målt ved mikrodalyse. Det menes generelt, Ca^{2 +} afhængige frigivelse er af neuronal oprindelse, hvorimod Ca^{2 +} selvstændig frigivelsen stammer fra glia, men mange undersøgelser rejst kontrovers over betydningen af Ca^{2 +}-følsomme målinger af f.eks. glutamat eller GABA⁹: således, hvis det er muligt, er det tilrådeligt at støtte mikrodalyse undersøgelser med mikrosensorer undersøgelser, som sidstnævnte har højere spatial opløsning og elektroderne giver mulighed for at komme tættere på synapser³¹.

Vedrørende mikrodalyse undersøgelser i epileptiske dyr er det vigtigt at understrege, at oplysninger indhentet fra de fleste af dem afhængige af video eller video-EEG overvågning af anfald, dvs, forbigående forekomsten af tegn og/eller symptomer på grund af unormale overdreven eller synkron neuronal aktivitet i hjernen³². Der er noget specielt for electrographic anfald i pilocarpin behandlet dyr, som bør overvejes, når du forbereder eksperimentet. Spontane anfald efterfølges af deprimeret aktivitet med hyppige EEG interictal pigge³ og forekomme i klynger^33,34. Forlorne drives ikke-epileptiske dyr kan udstille beslaglæggelse-lignende aktivitet³⁵ og derfor parametre for EEG optagelser evaluering bør være standardiseret³⁶ og, hvis det er muligt, timingen af mikrodalyse sessioner skal være veldefineret. Endelig, vi varmt anbefale følgende principper og metodologiske standarder for video-EEG overvågning i kontrol voksen gnavere skitseret af eksperter fra internationale liga mod epilepsi og amerikanske epilepsi samfund i deres meget nylige rapporterne^{37 ,38}.

Her beskriver vi mikrodalyse af glutamat og aspartat parallelt med de langsigtede video-EEG optagelser i epileptiske dyr og deres analyse i den dialysat ved HPLC. Vi vil understrege de kritiske trin i den protokol, som man bør tage sig af for bedste resultat.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer er blevet godkendt af universitetet i Ferrara institutionelle Animal Care og brug udvalget og af det italienske sundhedsministerium (tilladelse: D.M. 246/2012-B) i overensstemmelse med retningslinjerne i de Europæiske Fællesskabers Rådets direktiv af 24 November 1986 (86/609/EØF). Denne protokol er specielt tilpasset glutamat og aspartat bestemmelse i rat brain dialysates opnået under EEG kontrol af mikrodalyse sessioner i epileptiske og ikke-epileptiske rotter. Mange af de materialer…

Representative Results

Sonden opsving Den gennemsnitlige genfindelse (dvs. den gennemsnitlige aminosyre indhold i perfusate som en procentdel af indholdet i et lige saa stort volumen af hætteglasset løsning) var 15.49 ± 0,42% med en væskehastighed på 2 μl/min og 6,32 ± 0,64 3 μL/min. for glutamat og 14.89 ± 0,36% med en væskehastighed på 2 ΜL/min og 10.13 ± 0,51 3 μL/min. for aspartat når du bruger cuprophane membran sonde. Hvis …

Discussion

I dette arbejde viser vi, hvordan en kontinuerlig video-EEG registrering kombineret med mikrodalyse kan udføres i en eksperimentel model af FLE. Video-EEG optagelse teknikker bruges til at korrekt diagnosticere de forskellige faser af sygdomsprogression i dyr og mikrodalyse teknik bruges til at beskrive de ændringer i glutamat udgivelse, der forekommer i tid (ingen ændringer er blevet fundet for aspartat i en tidligere offentliggjort undersøgelse²). Vi anbefaler brugen af en enkelt enhed/impla…

Materials

3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
guide cannula	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml – tramadol	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	Material
probe clip holder	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml – diazepam	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	Material
1 mL syringe with 25G needle	Vetrotecnica, Padova, Italy	11.3500.05	Material
rat flexible feeding needle 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
digital video surveillance system	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Equipment
microdialysis probe	Agn Tho's, Lindigö Sweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
microdialysis probe	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	Material
block heater	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Equipment
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
infusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
fine bore polythene tubing	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blue tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL syringe with 22G needle	Chemil, Padova, Italy	S02G22	Material
vial cap	Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
glass insert with bottom spring	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	Material
autosampler vial	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit	Knauer, Berlin, Germany	V7602	Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump	Knauer, Berlin, Germany	V7603	Equipment
spectrofluorometric detector	Shimadzu, Kyoto, Japan	RF-551	Equipment
chromatogrphic column	Knauer, Berlin, Germany	25EK181EBJ	Material
chromatogrphic pre-column	Knauer, Berlin, Germany	P5DK181EBJ	Material
mobile phase solution A	0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0		Solution
mobile phase solution B	40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5		Solution
Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modified Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
saline	0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0		Solution
sucrose solution	10% sucrose in distilled water		Solution