Microdialisi degli aminoacidi eccitanti durante le registrazioni di EEG in liberi di muoversi

Summary

Qui, descriviamo un metodo per microdialisi in vivo analizzare il rilascio del glutammato e aspartato nell’ippocampo ventrale dei ratti epilettici e non-epilettici, in combinazione con le registrazioni di EEG. Concentrazioni extracellulari di aspartato e glutammato possono essere correlate con le diverse fasi della malattia.

Abstract

Microdialisi sono una tecnica consolidata neuroscienze che correla le modifiche di neurologico attivi diffusione nello spazio interstiziale del cervello con il comportamento e/o con l’esito specifico di una patologia (ad es., crisi epilettiche per l’epilessia). Quando si studia l’epilessia, la tecnica della microdialisi è spesso combinata con a breve termine o addirittura a lungo termine dei video-elettroencefalografia (EEG) di monitoraggio per valutare la frequenza di grippaggio spontaneo, gravità, progressione e clustering. Il microdialysis-EEG combinato si basa sull’uso di diversi metodi e strumenti. Qui, abbiamo effettuato mediante microdialisi in vivo e continuo dei video-EEG registra a monitor di glutammato e aspartato di deflusso nel tempo, nelle diverse fasi della storia naturale dell’epilessia in un modello del ratto. Questo approccio combinato consente l’abbinamento delle modifiche nel rilascio del neurotrasmettitore con specifiche fasi della progressione e lo sviluppo della malattia. La concentrazione dell’amminoacido nel dializzato è stata determinata per cromatografia liquida. Qui, descriviamo il metodi e delineare le principali misure di precauzione uno dovrebbero prendere durante la microdialisi in vivo -EEG, con particolare attenzione alla chirurgia stereotassica, stimolazione basale e alto potassio durante microdialisi, profondità registrazione degli elettrodi EEG e analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni di aspartato e glutammato nel dializzato. Questo approccio può essere adattato per testare una varietà di droga o di malattia ha indotto cambiamenti delle concentrazioni fisiologiche di aspartato e glutammato nel cervello. A seconda della disponibilità di un appropriato test analitico, possono essere ulteriormente utilizzato per testare diverse molecole solubili quando si impiegano registrazione EEG allo stesso tempo.

Introduction

Per consentono di comprendere il danno funzionale di neurotrasmissione eccitatorio e GABAergic neurotrasmissione inibitoria conseguente crisi epilettiche spontanee nell’epilessia del lobo temporale (TLE), abbiamo monitorato sistematicamente concentrazioni extracellulari di GABA¹ e successivamente i livelli di glutammato e aspartato² mediante microdialisi nell’ippocampo ventrale dei ratti in vari momenti della malattia naturale corso, vale a dire, durante lo sviluppo e la progressione dell’epilessia. Abbiamo approfittato del modello Pilocarpina TLE in ratti, che imita la malattia con estrema precisione in termini di cambiamenti comportamentali, elettrofisiologici e istopatologico^3,4 e abbiamo correlato la concentrazione del dializzato di aminoacidi acidi di sue diverse fasi: la fase acuta dopo l’insulto epilettogena, la fase di latenza, tempo del primo grippaggio spontaneo e la phass cronica^5,6,7. Inquadrare le fasi di malattia è stato attivato dal controllo del video-EEG a lungo termine e preciso EEG e caratterizzazione clinica di crisi epilettiche spontanee. Applicazione della tecnica del microdialysis connesso con controllo video-EEG a lungo termine ci ha permesso di proporre ipotesi meccanicistiche per neuropatologia TLE. In sintesi, la tecnica descritta in questo manoscritto permette l’abbinamento delle alterazioni neurochimiche all’interno di un’area definita del cervello con lo sviluppo e la progressione dell’epilessia in un modello animale.

Dispositivi associati, costituiti da un elettrodo di profondità giustapposto a una cannula di microdialisi, sono spesso impiegati in studi di ricerca di epilessia dove cambiamenti in neurotrasmettitori, loro metaboliti o substrati di energia dovrebbero essere correlate all’attività neuronale. Nella maggior parte dei casi, viene utilizzato a comportarsi liberamente gli animali, ma può anche essere condotta in modo simile in esseri umani, per esempio, in pazienti epilettici farmaco-resistente in fase di indagine di elettrodo di profondità prima della chirurgia⁸. Registrazione EEG sia dializzato raccolta può essere eseguita separatamente (ad esempio, impiantare l’elettrodo in un emisfero e la microdialisi della sonda in altro emisfero o anche eseguendo il microdialysis in un gruppo di animali durante l’esecuzione il suola EEG in un altro gruppo di animali). Tuttavia, gli elettrodi di accoppiamento a sonde può avere molteplici vantaggi: esso semplifica la chirurgia stereotassica, limita il danno di tessuto a un solo emisfero (mentre l’altra, lasciando intatti, come un controllo per gli esami istologici) e omogeneizza i risultati come questi sono ottenuti dalla stessa regione del cervello e l’animale stesso.

D’altra parte, la preparazione del dispositivo accoppiato microdialysis sonda elettrodo richiede abilità e il tempo se è fatta in casa. Uno potrebbe spendere quantità relativamente elevate di denaro se acquistato dal mercato. Inoltre, quando la microdialisi sonde (punte della sonda sono in genere 200-400 µm di diametro e 7-12 mm di lunghezza) sono⁹e gli elettrodi EEG (elettrodi sono solitamente di 300-500 µm di diametro e abbastanza a lungo per raggiungere la struttura del cervello di interesse¹⁰) accoppiato, il dispositivo montato rappresenta un oggetto ingombrante e relativamente pesante su un lato della testa, che è fastidioso per gli animali e incline a essere perso specialmente quando è collegato alla pompa dialisi e il sistema di registrazione EEG di filo duro. Questo aspetto è più rilevante negli animali epilettici che sono difficili da gestire e meno adattivo per le sessioni di microdialysis. Tecniche chirurgiche adeguate e appropriate cure post-operatorie possono provocare gli impianti di lunga durata che causano disagio minimo animale e dovrebbero essere perseguiti per esperimenti di microdialisi combinatorio-EEG^{10,11, 12}.

Vantaggi e limiti della tecnica microdialysis sono stati esaminati in dettaglio da molti neuroscienziati. Il suo vantaggio primario rispetto ad altre in vivo aspersione tecniche (ad es., flusso rapido push-pull o aspersione corticale tazza) è un piccolo diametro della sonda che copre una zona relativamente precisa di interesse^{13,14, 15}. In secondo luogo, la membrana di microdialysis crea una barriera fisica tra il tessuto e il perfusato; Pertanto, sostanze di alto peso molecolare non attraversano e non interferire con le analisi^16,17. Inoltre, il tessuto è protetta dal flusso turbolento del perfusato¹⁸. Un altro importante vantaggio è la possibilità di modificare il flusso di perfusato per massimizzare la concentrazione dell’analita nel perfusato (cioè, il processo di microdialysis può ben essere definito matematicamente e può essere modificato per alto rendimento concentrazione dell’analita nel campione)¹⁹. Infine, la tecnica può essere utilizzata per infondere i farmaci o sostanze farmacologicamente attive nel tessuto di interesse e determinare il loro effetto presso il sito di intervento²⁰. D’altra parte, microdialisi ha un tempo di risoluzione limitata (in genere più di 1 min a causa del tempo necessario per la raccolta di campioni) rispetto ai sensori elettrochimici o biologici; è una tecnica invasiva che provoca danni ai tessuti; compromette l’equilibrio neurochimico all’interno dello spazio intorno alla membrana dovuto la pendenza di concentrazione continua di tutte le sostanze solubili che entra il perfusato insieme con l’analita di interesse. Infine, la tecnica della microdialisi è fortemente influenzata dai limiti delle tecniche analitiche utilizzate per la quantificazione di sostanze del perfusato^9,21,22,23 . La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) dopo derivatizzazione con orthophthaldialdehyde per l’analisi di glutammato e aspartato in campioni biologici è stato convalidato ben^{24,25,26 , 27} e la sua vasta discussione è fuori della portata di questo manoscritto, ma i dati prodotti con questo metodo verranno descritti in dettaglio.

Quando eseguita correttamente e senza modifiche della composizione di perfusato, microdialisi è in grado di fornire informazioni attendibili circa i livelli basali del rilascio di neurotrasmettitore. La maggior parte dei livelli basali è probabilmente il risultato di spillover trasmettitore da sinapsi⁹. Perché in molti casi il campionamento semplice del neurotrasmettitore nello spazio sinaptico extra non è sufficiente a perseguire gli obiettivi di un’inchiesta, la tecnica della microdialisi può essere impiegata anche per stimolare i neuroni o di privarli di importanti ioni fisiologici come K⁺ o Ca^{2 +}, al fine di evocare o impedire il rilascio del neurotrasmettitore.

Alta K⁺ stimolazione viene spesso utilizzata in neurobiologia per stimolare l’attività neuronale non solo negli animali svegli, ma anche nelle colture primarie e organotipiche. L’esposizione di un sano sistema nervoso centrale a soluzioni con alte concentrazioni di K⁺ (40-100 mM) evoca l’efflusso di neurotrasmettitori²⁸. Questa capacità dei neuroni di fornire una versione aggiuntiva in risposta ad alta K⁺ può essere compromessa in animali epilettici¹ e in altre malattie di neurodegenerative^29,30. Allo stesso modo, il Ca^{2 +} privazione (ottenuta irrorando soluzioni Ca^{2 +} libera) viene utilizzata per stabilire calcio-dipendente rilascio di neurotrasmettitori più misurati dal microdialysis. Si ritiene generalmente che il Ca^{2 +} dipendente rilascio è di origine neuronale, considerando che il rilascio di Ca^{2 +} indipendente proviene da cellule gliali, ma molti studi sollevato polemiche sopra il significato di Ca^{2 +}-misure sensibili di es. glutammato o GABA⁹: così, se possibile, si consiglia di sostenere gli studi di microdialisi con microsensor studi, come questi ultimi hanno una più alta risoluzione spaziale e gli elettrodi consente di avvicinarsi alla sinapsi³¹.

Per quanto riguarda gli studi di microdialisi in animali epilettici, è importante sottolineare che i dati ottenuti dalla maggior parte di essi si basano su video o video-EEG monitoraggio dei grippaggi, cioè, dell’occorrenza transitoria di segni e/o i sintomi dovuto anormale sincrone o eccessiva attività neuronale nel cervello³². Ci sono alcune specifiche dei grippaggi elettrografici negli animali trattato Pilocarpina che dovrebbero essere considerati quando si prepara l’esperimento. Crisi epilettiche spontanee sono seguiti da attività depressa con frequenti punti interictal di EEG³ e si verificano in cluster^33,34. Sham azionati non-epilettici animali possono esibire grippaggio-come attività³⁵ e pertanto i parametri per la valutazione di registrazioni EEG dovrebbero essere standardizzato³⁶ e, se possibile, i tempi di microdialysis sessioni dovrebbero essere ben definito. Infine, ti raccomandiamo vivamente di seguire i principi e le norme metodologiche per controllo del video-EEG in roditori adulti controllo delineato dagli esperti della International League Against Epilepsy e società americana di epilessia nei loro rapporti molto recenti^{37 ,38}.

Qui, descriviamo il microdialysis del glutammato e aspartato in parallelo con le registrazioni video-EEG a lungo termine negli animali epilettici e la loro analisi nel dializzato da HPLC. Ci metterà in risalto i passaggi critici del protocollo che uno dovrebbe prendersi cura di per il miglior risultato.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall’Università di Ferrara istituzionale Animal Care e uso Comitato e dal Ministero italiano della salute (autorizzazione: D.M. 246/2012-B) in conformità con le linee guida delineate nelle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Questo protocollo è specificamente regolato per la determinazione del glutammato e aspartato in dializzato di cervello di ratto ottenuti sotto controllo EEG delle sessioni di microdialisi in ratti epilett…

Representative Results

Recupero della sonda Il recupero medio (cioè, il contenuto medio dell’amminoacido nel perfusato come percentuale del contenuto in un volume uguale di soluzione flaconcino) era 15.49 ± 0,42% ad una portata di 2 μL/min e 6.32 ± 0,64 a 3 μL/min per il glutammato e 14.89 ± 0,36% ad una portata di 2 ΜL/min e 10.13 ± 0.51 a 3 μL/min per aspartato quando si utilizza la sonda di membrana cuprophane. Se si utilizza la son…

Discussion

In questo lavoro, vi mostriamo come una registrazione video-EEG continua accoppiata con microdialisi può essere eseguita in un modello sperimentale di TLE. Vengono utilizzate tecniche di registrazione video-EEG per diagnosticare correttamente le diverse fasi di progressione della malattia negli animali e la tecnica della microdialisi è usata per descrivere i cambiamenti nel rilascio di glutammato che si verificano nel tempo (i cambiamenti non sono stati trovati per aspartato in un studio precedentemente pubblicato<sup …

Materials

3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
guide cannula	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml – tramadol	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	Material
probe clip holder	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml – diazepam	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	Material
1 mL syringe with 25G needle	Vetrotecnica, Padova, Italy	11.3500.05	Material
rat flexible feeding needle 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
digital video surveillance system	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Equipment
microdialysis probe	Agn Tho's, Lindigö Sweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
microdialysis probe	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	Material
block heater	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Equipment
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
infusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
fine bore polythene tubing	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blue tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL syringe with 22G needle	Chemil, Padova, Italy	S02G22	Material
vial cap	Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
glass insert with bottom spring	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	Material
autosampler vial	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit	Knauer, Berlin, Germany	V7602	Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump	Knauer, Berlin, Germany	V7603	Equipment
spectrofluorometric detector	Shimadzu, Kyoto, Japan	RF-551	Equipment
chromatogrphic column	Knauer, Berlin, Germany	25EK181EBJ	Material
chromatogrphic pre-column	Knauer, Berlin, Germany	P5DK181EBJ	Material
mobile phase solution A	0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0		Solution
mobile phase solution B	40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5		Solution
Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modified Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
saline	0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0		Solution
sucrose solution	10% sucrose in distilled water		Solution