自由行動ラットの脳波記録中に興奮性アミノ酸の透析
Summary
ここでは、腹側海馬脳波との組み合わせで、てんかんと非てんかんラットのアスパラギン酸とグルタミン酸のリリースを分析する体内マイクロダイアリシス法について述べる。アスパラギン酸とグルタミン酸の細胞外濃度は、病気のさまざまな段階と相関があります。
Abstract
マイクロダイアリシスは病理学 (例えば発作の結果および/または動作と脳の間質性スペースに拡散神経学的活性物質の変化と相関関係を確立された神経科学技術てんかん)。てんかんを勉強、マイクロダイアリシス法、しばしば短期もしくは長期的ビデオ-脳波 (EEG) 自発性発作頻度、重症度、進行およびクラスタ リングを評価する年次モニタリングと組み合わせてください。複合マイクロダイアリシス脳波は、いくつかのメソッドと楽器の使用に基づいています。ここでは、体内マイクロダイアリシスと連続ビデオ脳波モニターのグルタミン酸とアスパラギン酸の流出ラットモデルにおけるてんかんの自然史のさまざまなフェーズでの時間をかけて記録を行った。この手法により、病気の発症や進行の特定の段階で神経伝達物質のリリースにおける変更点の組み合わせ。液体クロマトグラフィーによる透析液中アミノ酸濃度を測定しました。ここでは、メソッドおよびプリンシパルの予防措置の 1 つは生体内で透析中に取る必要がありますのアウトラインについて述べる-定位手術には特に注意、マイクロダイアリシス、深さの中に基底部および高カリウム刺激と脳波電極脳波記録と透析液中グルタミン酸とアスパラギン酸の高速液体クロマトグラフィー分析。このアプローチを適合させることが薬物や疾患の様々 なテストするアスパラギン酸とグルタミン酸が脳内の生理学的濃度変化を誘発します。適切な分析法によります、それがさらに使用する同時に脳波記録を採用する際に異なる水溶性分子をテストします。
Introduction
興奮性グルタミン酸性の機能障害および gaba 作動性抑制性神経伝達側頭葉てんかん (TLE) の自然発作の結果への洞察力を提供するために我々 は体系的に監視の細胞外濃度GABA1と後で自然の病気の様々 な時点でラットの腹側海馬におけるマイクロダイアリシスによってグルタミン酸とアスパラギン酸の2レベル コース、すなわちてんかんの発生と進行中。我々 は行動、電気生理学的および病理組織学的変化の3,の4の面で非常に正確に病気を模倣しているラットでは, TLE ピロカルピン モデルの利点を取り、我々 はアミノ酸の透析液の濃度相関そのさまざまな段階酸: てんかんの侮辱、潜伏段階、最初の自然発作の慢性 phass5,6,7時間後急性期。病相をフレーミングは、長期ビデオ脳波モニタリングし正確な脳波と自然発作の臨床評価によって有効にされました。マイクロダイアリシス法のアプリケーション関連付けられて長期ビデオ脳波モニタリング TLE 分子病態のメカニズムの仮説を提案することができました。要約すると、本稿で説明する手法により開発てんかん動物モデルでの進行と定義されている脳領域内の神経化学的変化の組み合わせ。
マイクロダイアリシス カニューレに並置されている深度電極から成っているペアのデバイスは、神経活動に神経伝達物質の代謝やエネルギー基質の変化を関連付ける必要がありますのあるてんかんの研究に用いられます。広大な大部分のケースでは、自由に行動、使われますが、例えば手術8前深度電極調査薬物抵抗性てんかん患者の人間において、同様の方法でも実施することができます。脳波記録と透析液のコレクションの両方を個別に実行することがあります (例えば、1 つの半球で、マイクロダイアリシス電極を埋め込む他の半球または動物の 1 グループで、マイクロダイアリシスを実行するも実行中のプローブ唯一の脳波の動物の別のグループ)。ただし、電極をプローブに結合が複数の利点をある: それは定位手術を簡素化、のみ 1 つの半球に組織損傷を制限 (他、そのまま組織学のコントロールとして、そのまま)、これら結果をビードブラストアロイ同じ脳の領域と同じ動物から取得されます。
その一方で、結合マイクロダイアリシス プローブ電極素子の作製には、自家製の場合、スキルと時間が必要です。市場から購入した場合、1 つはお金の比較的高い量を過ごすことができました。また、マイクロダイアリシス プローブのとき (プローブ ・ チップは通常 200-400 μ m 径、長さ 7-12 mm)9、脳波電極 (電極、通常利息10の頭脳の構造に到達する 300-500 μ m、直径と十分な長さの)、結合、マウントされたデバイスは、動物の面倒は、透析ポンプと硬銅線脳波記録システムに接続されているとき特に失われる傾向が頭の片側にかさばるし、比較的重いオブジェクトを表します。この側面は、扱いにくく、マイクロダイアリシス セッションにあまり適応てんかん動物でより適切です。適切な手技と適切な術後ケアは最小限の動物の不快感を引き起こすと組合せマイクロダイアリシス脳波実験10、11,のために追求する必要があります長期的なインプラントにつながる12。
利点とマイクロダイアリシス法の制限は、多くの神経科学者によって詳細に検討されています。その他体内灌流のテクニック (例えば、高速流プッシュプルまたは皮質カップ灌流) をその主な利点は関心13,14、比較的正確な領域をカバーするプローブの小径 15。第二に、透析膜は、組織と出納; の間の物理的な障壁を作成しますしたがって、高分子量物質を横断しないし、解析16,17に干渉しません。さらに、組織は、出納18の流れから保護されています。もう一つの重要な利点液検体濃度を最大化するための流量を変更する可能性がある (すなわちマイクロダイアリシスのプロセスも数学的に定義することができ、高収量に変更することができますサンプルの試料の濃度)19。最後に、興味の組織に薬や薬理活性物質を注入して介入の20のサイトに及ぼす影響を確認する技術を使用可能性があります。その一方で、マイクロダイアリシス; 電気化学的または生物学的センサーと比較して解像度に制限時間 (サンプルを収集するために必要な時間のため通常より 1 分) にはそれは組織の損傷を引き起こす襲です。興味の analyte と出納に入るすべての可溶性物質の連続濃度勾配による膜の周りの空間内で神経バランスが損なわれます。最後に、マイクロダイアリシス法は非常に出納9,21,22,23 物質の定量化のための解析技法の制限による影響します。.高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 生体試料中のグルタミン酸とアスパラギン酸の分析のための orthophthaldialdehyde 誘導体化が非常に有効24,25,26をされた後,27と広範な議論は本稿の範囲外ですが、このメソッドを使用して、生成されるデータの詳細に記載されます。
適切かつ液組成の変更なしに実行される、マイクロダイアリシスは伝達物質の放出の基底のレベルについての信頼できる情報を提供できます。基底レベルの最大の部分はシナプス9からの波及の送信機の結果が。神経細胞を刺激するためにまたは重要な奪うマイクロダイアリシス法ことができますも採用不足のため多くの場合で余分なシナプス領域の神経伝達物質の簡単なサンプリング調査の目標を追求する、K+または Ca2 +、するために呼び起こす神経伝達物質の放出を防ぐなどの生理的イオン。
高 K+刺激は、神経生物学目を覚まし動物のみならずプライマリおよび切片培養における神経細胞の活動を刺激するために使用されます。高濃度 K+ (40-100 mM) のソリューションに健康的な中枢神経系の露出は、神経伝達物質28の流出を連想させます。てんかん動物1その他神経変性疾患29,30高 K+に応えて追加リリースを提供するニューロンのこの機能が損なわれる可能性があります。同様に、2 +剥奪 (Ca2 +無料ソリューションを灌によって得られた) は、カルシウム依存性を確立に使用される Ca はマイクロダイアリシスによるほとんどの神経伝達物質のリリースします。グリア細胞に由来する Ca2 +独立したリリースが、多くの研究は、Ca2 +の意味の論争を提起に対し神経起源の Ca2 +依存リリースであることを一般に考えられている-の高感度測定などグルタミン酸や GABA9: したがって、可能であれば、それはこれらの後者より高い空間分解能と電極がシナプス31に近づくようにマイクロ センサーの研究、マイクロダイアリシス研究をサポートすることをお勧めします。
てんかん動物マイクロダイアリシス研究に関するそれらのほとんどから得られたデータがビデオまたはビデオ脳波モニタリング発作、すなわち、徴候および/または異常に起因する症状の一時的な発生の依存を強調することが重要です。32脳の神経活動を過度または同期。ピロカルピン扱われる動物実験を準備する際に考慮すべきアノキシア発作のいくつかの詳細があります。自然発作は頻繁に脳波発作間欠期スパイク3落ち込んで活動が続いているし、クラスター33,34で発生します。偽運営非てんかん動物が発作のような活動35を示すことがありますしたがって脳波記録の評価パラメーターは、標準化された36をする必要があり、可能であれば、マイクロダイアリシス セッションのタイミングが明確に定義する必要があります。最後に、彼らの非常に最近のレポート37 の国際連盟はてんかんに対して、アメリカてんかん学会の専門家によって説明次の原理と方法論的規準ビデオ脳波モニタリング コントロール アダルト齧歯動物でお勧め ,38。
ここでは、グルタミン酸とアスパラギン酸てんかん動物の長期脳波ビデオと高速液体クロマトグラフィーによる透析液の分析と並行しての透析について述べる。1 つは最もよい結果のための世話をする必要がありますプロトコルの重要なステップを強調します。
Protocol
フェラーラ機関動物ケアおよび使用委員会の大学、イタリア保健省、すべての実験プロシージャを承認されている (承認: D.M. 246/2012-B) 欧州共同体で説明したガイドラインに従い1986 年 11 月 24 日 (86/609/EEC) の理事会指令」。このプロトコルは、てんかんと非てんかんラットにおけるマイクロダイアリシス セッションの脳波制御の下で得られたラット脳透析におけるグルタミン酸とアスパラギン…
Representative Results
プローブの回復 平均の回復 (つまり、バイアル ソリューションの等量のコンテンツに対するパーセンテージとして出納の平均アミノ酸含量) は 6.32 ± 0.64 3 μ L/分、グルタミン酸の 2 μ L/分の流量で 15.49 ± 0.42% と 2 の流量で 14.89 ± 0.36% Μ L/min. 10.13 ± 0.51 3 μ L/分 cuprophane 膜プローブを使用するときはアスパラギン酸、平?…
Discussion
この作品では TLE の実験モデルにおけるマイクロダイアリシスと相まって連続ビデオ脳波記録を実行する方法を示す.動物の病気の進行の各段階を正しく診断するビデオ脳波記録技術が使用され (変更はありませんの時間で発生するグルタミン酸放出の変化を記述するマイクロダイアリシス法を使用以前に発行された研究2ではアスパラギン酸)。強くお勧めできる単一のデバイ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者の優先順位で掲載された論文等への貢献のアンナ Binaschi、パオロ ・ Roncon、エレオノーラ パルマを感謝したいです。
Materials
| 3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
| Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
| Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
| Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
| Altadol 50 mg/ ml – tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
| Gentalyn 0.1% crm – gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
| simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
| probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
| Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
| Valium 10 mg/2 ml – diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
| 1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
| rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
| microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
| microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
| block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
| stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
| infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
| fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
| blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
| red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
| 2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
| vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
| septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
| glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
| autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
| Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
| Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
| spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
| chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
| chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
| mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
| mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
| Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
| saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
| sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |
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Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).