Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

Resumo

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Resumo

Microdialysis é uma técnica bem estabelecida neurociência que correlaciona as alterações de substâncias neurologicamente activas difusão no espaço intersticial do cérebro com o comportamento e/ou com o resultado específico de uma patologia (por exemplo, convulsões para a epilepsia). Ao estudar a epilepsia, a técnica do microdialysis é frequentemente combinada com a curto prazo ou mesmo a longo prazo vídeo-Eletroencefalografia (EEG de monitoramento para avaliar a frequência de apreensão espontânea, severidade, progressão e clustering). O combinado microdialysis-EEG baseia-se na utilização de vários métodos e instrumentos. Aqui, realizamos na vivo microdialysis e contínua de vídeo-EEG gravação ao monitor glutamato e aspartato de vazão ao longo do tempo, em diferentes fases da história natural da epilepsia em um modelo do rato. Esta abordagem combinada permite o emparelhamento das mudanças na versão do neurotransmissor com estágios específicos do desenvolvimento da doença e da progressão. A concentração de aminoácidos do dialisato foi determinada por cromatografia líquida. Aqui, descrevemos os métodos e as principais medidas de precaução devem tomar durante no vivo microdialysis de estrutura de tópicos-EEG, com particular atenção para a cirurgia estereotáxica, estimulação basal e alto de potássio durante microdialysis, profundidade eletrodo de EEG gravação e análise de cromatografia líquida de alta eficiência de aspartato e glutamato no dialisato. Esta abordagem pode ser adaptada testar uma variedade de drogas ou doenças induzidas por alterações das concentrações fisiológicas de aspartato e glutamato no cérebro. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico adequado, pode ser ainda mais usado para testar diferentes moléculas solúveis quando empregando gravação de EEG, ao mesmo tempo.

Introdução

Para fornecer insights sobre o comprometimento funcional da mediada por glutamato excitatório e neurotransmissão inibitória gabaérgica, resultando em convulsões espontâneas em epilepsia do lobo temporal (TLE), nós sistematicamente monitorada concentrações extracelulares de GABA¹ e depois do curso os níveis de glutamato e aspartato² por microdialysis no hipocampo ventral de ratos nos vários pontos de tempo da doença natural, ou seja, durante o desenvolvimento e progressão da epilepsia. Aproveitamos o modelo TLE pilocarpina em ratos, que imita a doença com grande precisão em termos de mudanças comportamentais, ele....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Ferrara institucional Animal cuidados e Comissão de uso e pelo Ministério da saúde italiano (autorização: D.M. 246/2012-B) em conformidade com as diretrizes descritas nas Comunidades Europeias Directiva do Conselho, de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo é especificamente ajustado para determinação de aspartato e glutamato no cérebro de rato dialysates obtidas sob controle de EEG do microdialysis sessões em ratos epilépticos e não-epiléptica. Muitos dos materiais descritos aqui podem ser facilmente substituídos com aqueles que usa em seu laboratório para gravações de EEG ou micro....

Resultados

Recuperação de sonda

A recuperação média (ou seja, o conteúdo do ácido aminado no perfusato como uma porcentagem do conteúdo em um volume igual de solução frasco) foi 15.49 ± 0,42% a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min e 6.32 ± 0,64 a 3 µ l/min por glutamato e 14.89 ± 0,36% a uma taxa de fluxo de 2 µ L/min e 10.13 ± 0,51 em 3 µ l/min para aspartato ao usar a sonda de membrana cuprophane. Se usar a sonda de membrana de poliacri.......

Discussão

Neste trabalho, mostramos como uma gravação de vídeo-EEG contínua juntamente com microdialysis pode ser executada em um modelo experimental de TLE. Técnicas de gravação de vídeo-EEG são usadas para diagnosticar corretamente as diferentes fases da progressão da doença em animais e a técnica do microdialysis é usada para descrever as alterações na liberação de glutamato que ocorrem no tempo (sem alterações foram encontradas para aspartato em um estudo publicado anteriormente²). Recomendamos o uso de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Eléctrodo de 3 canais de dupla torção	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Cânula guia de material
	Agn Tho's, Lindigö, Suécia	MAB 4.15.IC	Material
Resina KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Itália	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milão, Itália	2047420_71941	material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, França	221300288 (AIC)	Solução
Xylazine	Sigma, Milano, Itália	X1251	Material
Isoflurano-Vet	Merial, Toulouse, França	103120022 (AIC)	Solução
Altadol 50 mg/ml - tramadol	Formevet, Milano, Itália	103703017 (AIC)	Solução
Gentalyn 0,1% crm - gentamicina	MSD Italia, Roma, Itália	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japão	PN1167	Suporte de
clipe de sonda	Agn Tho's, Lindigö, Suécia	p/n 100 5001	Equipamento
Histoacrílico® Adesivo de Pele Tópico Azul	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, EUA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam	Roche, Monza, Itália	019995063 (AIC)	Material
Seringa de 1 mL com agulha 25G	Vetrotecnica, Padova, Itália	11.3500.05	Material
agulha de alimentação flexível de rato 17G	Agn Tho's, Lindigö Suécia	7206	Material
Grass Technology aparelho	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Califórnia, EUA	M665G08	Equipamento (amplificador AS40, caixa de cabeça, cabos de interconexão, telefator modelo RPSA S40)
aquisição modular de dados e  sistema de análise MP150	Biopac, Goleta, Califórnia, EUA	MP150WSW	Equipamento
sistema de vigilância por vídeo digital	AverMedia Technologies, Fremont, Califórnia, EUA	V4.7.0041FD
Sonda de microdiálise	Agn Tho's, Lindigö Suécia	MAB 4.15.1.	Sonda de
microdiálise	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, EUA	S-8010
Aquecedor de bloco	Grant Instruments, Cambridge, Inglaterra	QBD2	Agitador de equipamento
	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Itália	711
Equipamento bomba de infusão	Univentor, Zejtun, Malta	864	equipamento
tubo de polietileno de furo fino	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, EUA	800/100/100/100	Material
azul tubos adaptadores	Agn Tho's, Lindigö Suécia	1002	Material
vermelho tubos adaptadores	Agn Tho's, Lindigö Suécia	1003	Material
Seringa de 2,5 mL com agulha 22G	Chemil, Pádua, Itália	S02G22	Material
tampa do frasco	Cronus, Labicom, Olomouc, República Tcheca	VCA-1004TB-100	Material
septo	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, EUA	Nacional C4013-60 8 mm TEF/SIL septo	Material
inserção de vidro com mola inferior	Supelco, Sigma, Milão, Itália	27400-U	Frasco
amostrador automático	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 controlador de sistema e unidade de desgaseificação	Knauer, Berlim, Alemanha	V7602
Equipamento Smartline 1000 bomba de gradiente quaternário	Knauer, Berlim, Alemanha	V7603	Equipamento
detector espectrofluorométrico	Shimadzu, Kyoto, Japão	RF-551
Equipamento coluna cromatográfica	Knauer, Berlim, Alemanha	25EK181EBJ	Material
pré-coluna cromatográfica	Knauer, Berlim, Alemanha	P5DK181EBJ	Material
solução de fase móvel A	tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,0		Solução
solução de fase móvel B	Tampão fosfato de sódio 40% 0,1 M, 30% metanol, 30% acetonitrila, pH 6,5		Solução
Composição da solução de Ringer	em mM: MgCl2 0,85, KCl 2,7, NaCl 148, CaCl2 1,2, 0,3% BSA		Composição
da solução de Ringer modificada	com solução em mM: MgCl2 0,85, KCl 100, NaCl 50,7, CaCl2 1,2, 0,3% BSA		Solução
salina	0,9% NaCl, ph ajustado para 7,0		Solução
solução de sacarose	10% de sacarose em água		Solução

de material de material de material de de material destilada