Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion
Summary
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at identificere homologe rekombination begivenheder, der fandt sted i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige blotting og/eller PCR. Denne metode er eksemplificeret ved generation af nonmuscle myosin II genetiske udskiftning musemodeller ved hjælp af traditionelle embryonale stamcelle-baseret homologe rekombination-medieret målretning teknologi.
Abstract
Relative spørgsmål af off-target effekter og vanskeligheden ved at indsætte en lang DNA-fragment i anvendelsen af designer nukleaser for genom redigering, embryonale stamceller (ES) celle-baserede gen-targeting teknologi har ikke disse mangler og er bredt bruges til at ændre dyr/mus genom spænder fra store sletninger/Tilføjelser til enkelt nucleotid udskiftninger. Navnlig, at identificere de relativt få homologe rekombination (HR) begivenheder nødvendig for at opnå det ønskede ES kloner er et afgørende skridt, som kræver præcise og pålidelige metoder. Sydlige blotting og/eller konventionelle PCR er ofte brugt til dette formål. Her beskriver vi de detaljerede procedurer for at bruge disse to metoder til at identificere HR begivenheder, der fandt sted i mus ES-celler, hvor det endogene Myh9 genet er bestemt til at blive forstyrret og erstattet af cDNAs kodning andre nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). Hele proceduren i det sydlige blotting omfatter opførelse af målretning vector(s), elektroporation, drug udvælgelse, ekspansion og opbevaring af ES celler/kloner, forberedelse, fordøjelsen, og duppe genomisk DNA (gDNA), hybridisering og vask af sonderne og et sidste skridt af Autoradiografi på X-ray film. PCR kan udføres direkte med rede og fortyndet gDNA. For at opnå ideelle resultater, bør sonder og begrænsning enzym (RE) skære websteder for det sydlige blotting og primere for PCR planlægges omhyggeligt. Selv om udførelsen af det sydlige blotting er tidskrævende og arbejdskrævende og PCR resultater har falske positiver, den korrekte identifikation af sydlige blotting og hurtig screening af PCR tillade alene eller kombineret anvendelse af disse metoder, der beskrives i dette papir til almindeligt anvendte og høring af de fleste labs i identifikation af genotyper af ES-celler og genetisk modificerede dyr.
Introduction
Teknologien i gen målretning af HR i murine ES-celler giver et kraftfuldt værktøj til dissekere de cellulære konsekvenser af specifikke genetiske mutationer1,2. Vigtigheden og betydningen af denne teknologi er afspejlet i sin anerkendelse af 2007 Nobelprisen i fysiologi eller medicin3,4; i mellemtiden, repræsenterer det fremkomsten af den moderne æra af genet engineering5. Gen målretning gennem HR kan udnyttes til at ingeniør stort set enhver ændring lige fra punktmutationer til store kromosomale rearrangementer i genomet af musen ES celler6,7. Det er velkendt, at generation af et gen knockout mus før fremkomsten af såkaldte genom redigeringsværktøjer, kræves anvendelse af gen-targeting teknologi i ES celler8,9,10. I løbet af de seneste to årtier, blev mere end 5.000 gen-målrettet mus produceret af denne tilgang til modellering menneskelige sygdomme eller studerer genet funktioner11. En genome-wide knockout indsats er blevet etableret til at distribuere gen-targeting vektorer, målrettede ES celle kloner og levende mus til forskersamfundet2,12,13,14 , 15. uden tvivl ES cellebaserede HR-medieret gen-targeting teknologi er meget avanceret vores forståelse af funktionerne af gener spillede i fysiologiske eller patologiske sammenhæng.
Fordi HR er en forholdsvis sjælden begivenhed i pattedyr celler16,17, den vigtige og næste skridt efter er gen målretning i murine ES-celler at analysere talrige ES kolonier til at identificere et par kloner med mutationer som følge af HR med målrettet vektor18. Guld metoderne til identifikation HR begivenheder omfatter sydlige blotting og PCR19,20. Fordele ved metoderne omfatter at sydlige blotting kan identificere korrekt målrettet ES kloner og gør det muligt for forskere at analysere strukturen i den gen-målrettet begivenhed, som en bekræftelse af en enkelt kopi indsættelse af konstruktion, mens en PCR-baseret strategi tillader hurtig screening for HR begivenheder21,22. Selv om disse metoder har ulemper, som at de er tidskrævende og kan have falske positiver, den multikombinerbare brugen af dem er bredt accepteret og anvendt af de fleste labs i at identificere HR begivenheder, især i ES-celler, for generering af genetisk modificerede dyr.
Tre isoformer af nonmuscle myosin II (NM II) i pattedyr, hver bestående af to identiske NMHC IIs, der er kodet ved tre forskellige gener (opkaldt Myh9, Myh10 og Myh14) og to par Lyskæder, omtales som NM II-A, II-B og C II23. Tidligere undersøgelser har vist at mindst isoformer af NM II-A og II-B er afgørende for musen udvikling, fordi i vivo ablation af disse isoformer resulterer i embryonale dødelighed24,25,26. At omgå dette problem og få nye indsigter i isoform-specifikke funktioner NM II-A og II B i de senere stadier af udvikling af mus, en genetisk udskiftning strategi ved hjælp af ES cellebaserede HR-medieret gen-targeting teknologi blev vedtaget for at generere en serie af mus modeller27. I forbindelse med at identificere de ønskede ES kloner, både det sydlige blotting og PCR metoder blev udnyttet, og disse viste sig for at være effektive og pålidelige27,28.
Dette papir har til hensigt at give en detaljeret beskrivelse af det sydlige blotting og PCR, herunder design af målretning vector(s), sonderne, og primere og udførelsen af eksperimenter, samt analyse af resultater eksemplificeret ved at identificere HR begivenhed forekomst i ES-celler til at skabe genetisk udskiftning NM II mus modeller og repræsentative data. Protokoller af disse to metoder præsenteres her kan også vedtages for at identificere genotyper af genetisk modificerede celler eller dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
I øjeblikket, ikke kan designer nukleaser for genom-redigering stadig erstatte ES cellebaserede gen-targeting teknologi på grund af dens problemer af off-target effekter, og svært ved at indsætte en lang DNA fragment30,31. Som de gyldne metoder til at identificere HR begivenheder, der fandt sted i mus ES celler, indeholder denne rapport en detaljeret protokol sydlige blotting og PCR for feltet. Vi valideret pålideligheden af disse metoder ved at analysere en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde fik støtte fra programmet General National Natural Science Foundation of China (tilskud nr. 31571432), den menneskelige Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 2015JC3097) og den forskning fundament af uddannelse Præsidiet af Hunan (Grant No. 15 K 054)-provinsen, Kina.
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
