Storskalaproduksjon av rekombinant RNAs på en sirkulær stillaset med en Viroid-avledet System i Escherichia coli

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å produsere store mengder rekombinant RNA i Escherichia coli ved co uttrykker en chimeric RNA som inneholder RNA av interesse i en viroid stillaset og en plante tRNA ligase. Hovedproduktet er en sirkulær molekyl som forenkler rensing å homogenitet.

Abstract

Med økende interesse RNA biologi og bruk av RNA molekyler i avanserte bioteknologisk programmer, er metoder for å produsere store mengder av rekombinant RNAs begrenset. Her beskriver vi en protokoll for å produsere store mengder rekombinant RNA i Escherichia coli basert på co uttrykk for et chimeric molekyl som inneholder RNA av interesse i en viroid stillaset og en plante tRNA ligase. Viroids er relativt liten, ikke-koding, svært base-sammenkoblet sirkulære RNAs som er smittsom for høyere planter. Verten plante tRNA ligase er et enzym rekruttert av viroids som tilhører familien Avsunviroidae, som aubergine latente viroid (ELVd), for å megle RNA circularization under viroid replikering. Selv om ELVd replikerer ikke i E. coli, en ELVd forløper er effektivt transkribert av E. coli RNA polymerase og behandlet av den innebygde hammerhead ribozymes i bakterielle celler, og de resulterende monomerer er circularized av den co uttrykt tRNA ligase nådde en bemerkelsesverdig konsentrasjon. Innsetting av en rundt ELVd stillaset kan titalls milligram rekombinant RNA per liter bakteriell kultur i vanlig laboratorium. En viktigste brøkdel av RNA produktet er rund, en funksjon som forenkler rensing av rekombinant RNA til virtuelle homogenitet. I denne protokollen settes et komplementære DNA (cDNA) svarer til RNA rundt i en bestemt plassering av ELVd cDNA i et uttrykk plasmider som brukes, langs plasmider co uttrykke aubergine tRNA ligase, for å transformere E. coli. Co uttrykk for både molekyler under kontroll av sterke konstituerende arrangører fører til produksjon av store mengder av rekombinant RNA. Den rekombinante RNA kan utdraget fra bakterieceller og atskilt fra hoveddelen av bakteriell RNAs utnytter circularity sin.

Introduction

I motsetning til DNA og proteiner er protokoller for enkel, effektiv og kostnadseffektiv produksjon av store mengder RNA ikke rikelig. Men sofistikert forskning og industri etterspørsel økende mengder av disse biomolecules å undersøke deres unike biologiske egenskaper¹, eller å være ansatt i bioteknologisk programmer, inkludert deres bruk som svært spesifikke aptamers ², terapeutiske agenter³eller Selektiv plantevernmidler⁴. In vitro transkripsjon og syntese er vanlig i forskning for å produsere RNA. Men innebærer metodene viktige begrensninger når store mengder av produkter. Den logiske alternativet er å bruke endogene transkripsjon maskiner av levende celler, etterfulgt av en renselsesprosess skille RNAs rundt fra mobilnettet følgesvenner. Etter denne strategien, metoder har blitt utviklet til å produsere rekombinant RNAs i bakterielle celler, for eksempel lab-vennlig Escherichia coli⁵ eller den marine lilla phototrophic alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum ⁶. de fleste metoder for å produsere rekombinant RNA i bakterier stole på uttrykket av en innfødt svært stabile RNA skafottet, som en tRNA eller en rRNA, der RNA rundt er satt⁷. Dette medfører nødvendigheten av å slippe RNA rundt av chimeric molekylet, hvis ekstra RNA er et problem for nedstrøms programmer⁸. En annen begrep i rekombinant RNA bioteknologi er produksjonen av rekombinant ribonucleoprotein komplekser som kan være det ønskede produktet sådan eller brukes som en beskyttende strategi for å øke stabiliteten av RNA interesse^{9, 10}. Tilsvarende har produksjon av sirkulære RNAs også blitt foreslått som en strategi for å generere mer stabil produkter¹¹.

Vi har nylig utviklet en ny metode for å produsere store mengder rekombinant RNA i E. coli som deltar i tre av de ovennevnte begrepene: innsetting av RNA rundt i en svært stabile sirkulær RNA stillaset og co uttrykk for den rekombinant RNA med et samspill protein til trolig produsere en stabil ribonucleoprotein kompleks som akkumuleres i bemerkelsesverdig mengder i bakterielle celler¹². I motsetning til tidligere utviklingen brukte vi en RNA stillaset helt fremmed for E. coli, nemlig en viroid. Viroids er en meget spesiell type smittestoffer høyere planter som er utelukkende konstituert av en relativt liten (246-401 nt) svært base-sammenkoblet sirkulær RNA¹³. Interessant, viroids er ikke-koding RNAs, og uten hjelp fra sine egne proteiner, de er kjøpedyktig fullstendig komplekse smittsomme sykluser i den infiserte verter¹⁴. Disse syklusene ta RNA-til-RNA replikering i kjerner eller chloroplasts, avhengig av viroid familien,Pospiviroidae eller Avsunviroidae, henholdsvis-bevegelse gjennom infiserte anlegget og unndragelse av verten defensive svaret. Viroids må være rangert blant de mest stabile RNAs i naturen, som følge av å være en naken sirkulær RNA og måtte overleve i det fiendtlige miljøet av anlegget infiserte celler. Denne egenskapen kan gjøre viroids spesielt egnet som stillaser å stabilisere rekombinant RNA i bioteknologisk tilnærminger. I tillegg er den nye metoden basert på co uttrykk for viroid stillaset med et samspill planteprotein. Viroids replikere gjennom en rullende sirkel mekanisme i som vert enzymer er rekruttert til å katalysere de ulike trinnene i prosessen. Spesielt noen viroids, mer spesifikt de som tilhører familien Avsunviroidae¹⁵, inneholder ribozymes som er også involvert i replikering. Avhengig av den viroid arten, er transkripsjon av viroid RNAs formidlet av verten RNA polymerase II eller den chloroplastic kjernefysiske-kodet RNA polymerase (NEP). Viroid RNA behandling synes å være katalysert av en vert type-III RNase, selv om i viroids med ribozymes oligomeric RNA mellomprodukter selv cleave under replikering. Til slutt, de resulterende viroid monomerer er circularized, avhengig av viroid familien, vert DNA ligase 1 eller chloroplastic isoformen av tRNA ligase^16,17. Dette siste enzymet er involvert i ligation av de monomerisk viroids i familien Avsunviroidae, som aubergine latente viroid (ELVd)¹⁸.

På en jobb å analysere sekvensen og strukturelle kravene til ELVd som bestemmer anerkjennelse av aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi satt opp en eksperimentell system basert på co uttrykk for både molekyler i E. coli ¹⁹. vi merke til at lengre enn enheten ELVd transkripsjoner selv cleave effektivt i E. coli celler gjennom den innebygde hammerhead ribozymes og at de resulterende viroid monomerer med 5′-hydroksyl og 2, 3-phosphodiester termini var effektivt circularized av co uttrykt aubergine tRNA ligase. Enda mer, nådd den resulterende sirkulære viroid RNA et uventet høy konsentrasjon i E. coli, overstiger de av endogene rRNAs¹². Fravær av replikering mellomprodukter indikerte mangel ELVd RNA-til-RNA forsterkning i disse bakterielle celler. Interessant, hadde innsetting av heterologous RNAs i en bestemt plassering av viroid molekyl en moderat effekt på akkumulering av sirkulære viroid-avledet RNAs¹². Disse observasjonene gjort oss forestille en metode for å produsere store mengder av rekombinant RNAs i bakterier. I denne metoden cDNAs tilsvarer RNAs rundt settes inn i ELVd-cDNA og den resulterende chimeric RNA uttrykkes i E. coli gjennom en sterk konstituerende promoter. For at systemet skal fungere, må E. coli co forvandles med en plasmider å uttrykke den aubergine tRNA ligase. ELVd-avledet lengre enn enheten transkripsjon behandles av innebygde hammerhead ribozymes og de resulterende monomerer med de aktuelle termini gjenkjennes og circularized av co uttrykt tRNA ligase. På denne måten settes RNA rundt inn i en meget stabil sirkulær stillaset bestående av viroid sirkulær molekylet. Denne rekombinant chimeric RNA er trolig ytterligere stabiliseres i de E. coli cellene ved dannelsen av en ribonucleoprotein komplekse gjennom samspill med tRNA ligase. Denne metoden (se protokollen nedenfor), RNA aptamers, hårnål RNAs og andre strukturert RNAs er lett produsert i mengder titalls milligram per liter av E. coli kultur i vanlig laboratorium og renset til homogenitet tar Utnytt sirkularitet¹².

Protocol

1. plasmider konstruksjon Forsterke av PCR (eller omvendt transkripsjon PCR hvis starter fra en RNA mal) cDNA tilsvarer RNA rundt med primere med 5′ forlengelsen for å tillate forsamlingen uttrykk plasmider. For å unngå uønskede mutasjoner, bruk en høy-troskapen DNA polymerase. Sette på cDNA i uttrykket plasmider av Gibson montering20, legge følgende 5′ filtyper til PCR primere: fremover, 5-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3′; omvendt,…

Representative Results

For å produsere rekombinant RNA i E. coli bruker ELVd-avledet systemet12, podet RNA rundt inn i en ELVd RNA stillaset. Denne chimeric RNA er co uttrykt langs den aubergine tRNA ligase i E. coli. Når behandlet, kløyvde og circularized, danner chimeric sirkulær RNA, som RNA rundt stikker sannsynlig en ribonucleoprotein kompleks med co uttrykt aubergine enzymet som bemerkelsesverdig konsentrasjon i bakterieceller ( Figur 1</s…

Discussion

Mens forskning ELVd sekvensen og struktur krav involvert i erkjennelsen av aubergine tRNA ligase, la vi merke til at co uttrykk for både molekyler i ikke-vert E. coli førte til en uventede store opphopning av viroid runde skjemaer i bakterieceller¹⁹. Vi forsto at store akkumulering av viroid RNA i E. coli sannsynligvis var konsekvensen av co uttrykke en svært stabile RNA molekylet, som den relativt liten (333 nt), svært basert-sammenkoblet, sirkulære viroid og et protein som…

Materials

Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G