Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в Escherichia coli
Summary
Здесь мы представляем протокол производить большое количество рекомбинантных РНК в Escherichia coli совместно выразить химерных РНК, содержащий РНК интерес к вироиды леску и завод лигаза тРНК. Основным продуктом является циркуляр молекула, которая облегчает очистки до однородности.
Abstract
С ростом интереса к биологии РНК и использования молекул РНК в сложных биотехнологических приложений, методы производить большое количество рекомбинантных молекул РНК ограничены. Здесь мы описываем протокол производить большое количество рекомбинантных РНК в Escherichia coli на основе совместного выражения химерных молекулы, содержащий РНК интерес к вироиды леску и завод лигаза тРНК. Вироиды являются относительно небольшой, без кодирования, высоко в паре базы круговой РНК, которые являются инфекционные высших растений. Узел завод tRNA лигаза является ферментом, завербован вироиды, которые принадлежат к семейству Avsunviroidae, как баклажаны латентной вироиды (ELVd), выступить посредником РНК рецензий во время репликации вироиды. Хотя ELVd не реплицируется в E. coli, прекурсор ELVd эффективно транскрибируются РНК полимеразой E. coli и обработаны рибозимы встраиваемых молот в бактериальных клетках и результате мономеров circularized совместно выразили tRNA лигаза достижения замечательных концентрации. Включение РНК интерес в ELVd леса позволяет производство десятков миллиграмм рекомбинантного РНК за литр бактериальной культуры в регулярных лабораторных условиях. Основная часть продукта РНК круговые, особенность, которая облегчает очистки рекомбинантных РНК до виртуальных однородности. В этом протоколе взаимодополняющих ДНК — (cDNA кДНК) соответствует РНК интерес вставляется в определенной позиции ELVd cDNA в выражение плазмида, которая используется, вдоль плазмида выразить совместно баклажаны tRNA лигаза, чтобы преобразовать E. coli. Сопредседатель выражения обеих молекул под контролем сильных учредительный промоутеров приводит к производства большого количества рекомбинантных РНК. Рекомбинантных РНК могут быть извлечены из бактериальных клеток и отделены от основной части бактериальных RNAs воспользовавшись его округлости.
Introduction
В отличие от ДНК и белков протоколы для простой, эффективной и рентабельной производства большого количества РНК не обильные. Однако исследования и промышленность спроса все большее количество этих биомолекул расследовать их уникальные биологические свойства1, или на работу в сложных биотехнологических применений, включая их использование в качестве весьма конкретной аптамеры 2, терапевтические3или селективного пестицидов4. In vitro транскрипция и химического синтеза для производства РНК обычно используются в научных исследованиях. Однако эти методы предусматривают важные ограничения, когда требуются большие объемы продукции. Логической альтернативой является использование механизма эндогенного транскрипции живых клеток, последовал процесс очистки отделить RNAs интерес от сотовой товарищей. Следуя этой стратегии, были разработаны методы для получения рекомбинантных молекул РНК в бактериальной клетки, такие как лаборатории дружественный Escherichia coli5 или морской фиолетовый фототрофных альфа proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. Большинство методов для получения рекомбинантных РНК бактерий полагаются на выражение собственного высокостабильных РНК леску, такие как tRNA или рРНК, в котором находится РНК интерес вставлен7. Это накладывает необходимость освобождения РНК интерес из химерных молекулы, если наличие дополнительных РНК является проблемой для нисходящие приложения8. Другая концепция в рекомбинантной биотехнологии РНК является производство рекомбинантных рибонуклеопротеида комплексов, которые могут быть желаемого продукта per se или используются в качестве защитной стратегии для повышения стабильности РНК интерес9, 10. Аналогично производство круговой РНК также было предложено как стратегии для создания более стабильных продуктов11.
Мы недавно разработали новый метод производить большое количество рекомбинантных РНК в E. coli , который участвует в трех вышеупомянутых концепций: вставки РНК интерес к высокостабильных круговой РНК леску и Сопредседатель выражение рекомбинантных РНК с взаимодействуя белками вероятно производить стабильный рибонуклеопротеида комплекс, который накапливается в замечательной количествах в бактериальных клетках12. В отличие от предыдущих разработок мы использовали РНК эшафот, совершенно чужды кишечной палочки, а именно вироиды. Вироиды представляют собой особый тип инфекционных агентов высших растений, которые составляются исключительно на относительно небольшой (246-401 nt) высоко в паре базы круговой РНК13. Интересно, что вироиды не кодирования РНК, и без помощи от их собственных белков, они способны выполнять сложные инфекционные циклы в зараженных хостов14. Эти циклы относятся репликация РНК-РНК в ядрах или хлоропласты, в зависимости от семьи вироиды —Pospiviroidae или Avsunviroidae, соответственно — движение через зараженные растения и уклонение разместить защитную реакцию. Вироиды должны быть занимала среди наиболее стабильных РНК в природе, будучи голый круговой РНК и того, чтобы выжить в условиях враждебной зараженных растительных клеток. Это свойство может сделать вироиды особенно подходит как подмости для стабилизации рекомбинантной РНК в биотехнологических подходов. Кроме того новый метод на основе совместного выражения вироиды леску с взаимодействующих растительного белка. Вироиды реплицировать через механизм подвижного круга, в котором хозяин ферменты набираются стимулировать различные этапы этого процесса. Особенно некоторые вироиды, в частности тех, которые принадлежат к семье Avsunviroidae15, содержат рибозимы, которые также участвуют в репликации. В зависимости от видов вироиды транскрипция вироиды РНК при посредничестве принимающей РНК-полимераза II или хлоропластной-кодировке РНК-полимеразы (НЭП). Вироиды РНК обработки, как представляется, быть катализатором узлом РНКазы III типа, хотя в вироиды с рибозимы олигомерных РНК интермедиаты самостоятельно прилепится во время репликации. Наконец результате вироиды мономеров являются circularized, в зависимости от семьи вироиды, принимающей ДНК лигаза 1 или хлоропластной изоформы tRNA лигаза16,17. Этот последний фермент участвует в перевязки Мономерных форм вироиды в семье Avsunviroidae, как баклажаны латентной вироиды (ELVd)18.
В ходе работы проанализировать последовательность и структурных требований ELVd определяют признание, баклажаны (Solanum melongena L.) tRNA лигаза, мы создали экспериментальной системы на основе совместного выражения обеих молекул в E. coli 19. Мы заметили, что больше чем единица ELVd стенограммы самостоятельно эффективно расщеплять в клетках E. coli через встроенный молот рибозимы и что результате вироиды мономеров с 5′-гидроксильные и 2′, 3′-Фосфодиэфирная Термини эффективно circularized, совместно выразили баклажаны лигаза тРНК. Даже больше результирующий РНК круговой вироиды достигли неожиданные высокой концентрации в E. coli, превышающие эндогенного теорией12. Отсутствие посредников репликации указывает отсутствие усиления ELVd РНК-РНК в эти клетки бактерий. Интересно, что вставки гетерологичных РНК в определенной позиции вироиды молекулы имел умеренное воздействие на накопление круговой вироиды производные РНК-12. Эти замечания сделал нас себе метод производить большое количество рекомбинантных молекул РНК бактерий. В этом методе cDNAs соответствующий RNAs интерес вставляются в ELVd cDNA и результате химерных РНК выражается в E. coli через сильный учредительный промоутер. Для работы системы E. coli совместно должны быть преобразованы с плазмида выразить баклажаны лигаза тРНК. Стенограмма дольше чем блок ELVd производные обрабатывается рибозимы встраиваемых молот и результате мономеров с соответствующим Термини, признаются и circularized совместно выразили лигаза тРНК. Таким образом, в очень стабильные круговые эшафот, состоящий из вироиды циркуляр молекула вставляется РНК интерес. Этот рекомбинантных химерных РНК является наиболее вероятно далее стабилизировать внутри клеток E. coli путем формирования рибонуклеопротеида комплекса путем взаимодействия с тРНК лигаза. С помощью этого метода (см. Протокол ниже), были легко производится в количестве десятков миллиграмма на литр культуры е. coli в регулярных лабораторных условиях и очищен до однородности принимая аптамеры РНК, заколка РНК и других структурированных РНК преимущество округлости12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследуя ELVd последовательность и структура потребностей участвующих в признании, баклажаны лигаза tRNA, мы заметили, что Сопредседатель выражение обеих молекул в не хост E. coli привело к неожиданным большое накопление вироиды круговой формы в бактериальных клетках19. Мы ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантов BIO2017-83184-R и BIO2017-91865-EXP от испанской Ministerio де наук, Декабрь Innovación y (совместно финансируемых ФЕДЕР фонды).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
Referências
- Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
- Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
- Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
- Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
- Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
- Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
- Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
- El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
- Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
- Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
- Daròs, J. -. A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
- Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).
- Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
- Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
- Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
- Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
- Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
- Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
- Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
- Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
- López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).
