Aquí, presentamos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli Co expresando un ARN quimérico que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. El principal producto es una molécula circular que facilita la purificación a homogeneidad.
Con el aumento de interés en la biología del RNA y el uso de moléculas de ARN en aplicaciones biotecnológicas sofisticadas, los métodos para producir grandes cantidades de ARN recombinante son limitados. Aquí, describimos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli , basado en la expresión de una molécula quimérica que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. Los viroides son RNAs circular relativamente pequeños, no codificante, altamente vinculado de base que son infecciosos a las plantas superiores. El anfitrión planta Arnt Ligasa es una enzima reclutada por viroides que pertenecen a la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd), para mediar la circularización del RNA durante la replicación del Viroide. Aunque ELVd no replicar en e. coli, un precursor de ELVd eficientemente es transcrito por la ARN polimerasa de e. coli y procesado por la ribozimas de cabeza de martillo incrustado en células bacterianas, y los monómeros resultantes son circular por el Co expresado Arnt Ligasa alcanzando una notable concentración. La inserción de un RNA de interés en el andamio ELVd permite la producción de decenas de miligramos de recombinantes RNA por litro de cultivo bacteriano en condiciones de laboratorio regulares. Una fracción principal del producto RNA es circular, una característica que facilita la purificación del ARN recombinante a homogeneidad virtual. En este protocolo, un complementario DNA (cDNA) correspondiente del ARN de interés se inserta en una particular posición del cDNA ELVd en un plásmido de expresión que se utiliza, a lo largo de los plásmidos expresar Co berenjena Arnt Ligasa, para transformar e. coli. Coexpresión de ambas moléculas bajo el control de promotores constitutivos fuertes conduce a la producción de grandes cantidades de ARN recombinante. El ARN recombinante puede ser extraído de las células bacterianas y separado de la mayor parte del ARN bacteriano aprovechando su circularidad.
En contraste con el ADN y las proteínas, los protocolos para producción fácil, eficiente y rentable de grandes cantidades de ARN no son abundantes. Sin embargo, investigación e industria demanda cantidades crecientes de estas biomoléculas para investigar sus propiedades biológicas únicas1, o a emplearse en sofisticadas aplicaciones biotecnológicas, incluyendo su uso como aptámeros altamente específicos 2, agentes terapéuticos3o pesticidas selectivo4. Transcripción in vitro y la síntesis química se utilizan en la investigación para producir RNA. Sin embargo, estos métodos implican limitaciones importantes cuando se requieren grandes cantidades de los productos. La alternativa lógica es utilizar la maquinaria de transcripción endógena de las células vivas, seguido por un proceso de purificación para separar el ARN de interés de los compañeros celulares. Siguiendo esta estrategia, se han desarrollado métodos para producir arn recombinante en células bacterianas, tales como el ambiente de laboratorio de Escherichia coli5 o la Marina púrpura fototrófica alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. mayoría de los métodos para producir arn recombinante en las bacterias dependen de la expresión de un andamio de RNA muy estable nativa, tales como inserta de un tRNA o un rRNA, en el cual el RNA de interés es7. Esto impone la necesidad de liberar el RNA de interés fuera de la molécula quimérica, si la presencia de ARN extra es un problema para las aplicaciones posteriores8. Otro concepto en recombinante biotecnología de RNA es la producción de complejos de ribonucleoproteína recombinante puede ser el producto deseado por sí o usado como una estrategia protectora para aumentar la estabilidad del ARN de interés9, 10. Del mismo modo, la producción de RNAs circular también ha sugerido como una estrategia para generar productos más estable11.
Recientemente hemos desarrollado un nuevo método para producir grandes cantidades de RNA recombinante en e. coli que participa en tres de los conceptos anteriores: la inserción del RNA de interés en un andamio de RNA circular muy estable y la expresión conjunta de la células de RNA recombinante con una proteína interacción probable producir un complejo de ribonucleoproteína estable que se acumula en cantidades notables en bacterianas12. En contraste con los desarrollos anteriores, se utilizó un andamio de RNA totalmente ajeno a e. coli, es decir, un Viroide. Los viroides son un tipo muy particular de agentes infecciosos de plantas superiores que están constituidos exclusivamente por una relativamente pequeña (246-401 nt) muy vinculado a base de RNA circular13. Curiosamente, los viroides son no-codificación RNAs y, sin la ayuda de sus propias proteínas, que son capaces de completar ciclos infecciosos complejos en los anfitriones infectados14. Estos ciclos incluyen la replicación del ARN a ARN en el núcleo o cloroplastos, dependiendo de la familia de Viroide:Pospiviroidae o Avsunviroidae, respectivamente — movimiento a través de la planta infectada y la evasión de la respuesta defensiva del huésped. Viroides deben ser alineados entre los RNAs más estables en la naturaleza, como consecuencia de ser un ARN circular desnudo y tener que sobrevivir en el hostil ambiente de células de la planta infectada. Esta propiedad hace que los viroides particularmente conveniente como andamios para estabilizar recombinantes RNA en enfoques biotecnológicos. Además, el nuevo método se basa en la co-expresión del andamio Viroide con una interacción proteína vegetal. Viroides se replican mediante un mecanismo de círculo rodante en que host son reclutadas enzimas para catalizar las distintas etapas del proceso. En particular algunos viroides, concretamente aquellos que pertenecen a la familia Avsunviroidae15, contienen ribozimas que también participan en la replicación. Dependiendo de la especie de Viroide, transcripción de Viroide RNAs está mediada por el host de polimerasa II del RNA o el cloroplástico nuclear codificado polimerasa del RNA (NEP). Procesamiento Viroid RNA parece ser catalizado por un host Rnasa tipo III, aunque en viroides con ARN los ribozimas intermedios uno partirá durante la replicación. Por último, los monómeros resultantes del Viroide están circular, dependiendo de la familia de Viroide, por el ligase de la DNA del anfitrión 1 o la isoforma cloroplástico de tRNA ligase16,17. Esta última enzima participa en la ligadura de las formas monoméricas de los viroides de la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd)18.
En el curso de un trabajo para analizar los requisitos de ELVd secuencia y estructurales que determinan el reconocimiento de la berenjena (Solanum melongena L.) Arnt Ligasa, hemos creado un sistema experimental basado en expresión conjunta de ambas moléculas en e. coli 19. nos dimos cuenta que ELVd transcripciones de más que unidad Self-cleave eficientemente en las células de e. coli a través de los ribozimas de cabeza de martillo incrustado y que los monómeros resultantes de Viroide y 5′-hidroxilo 2′, 3′-fosfodiéster termini circular eficientemente por la berenjena Co expresado Arnt Ligasa. Más aún, el ARN Viroide circular resultante alcanzó una inesperada alta concentración en e. coli, superiores a las de los rRNAs endógeno12. Ausencia de replicación intermedios indica falta de amplificación ELVd ARN a ARN en las células bacterianas. Curiosamente, la inserción de RNAs heterólogos en una posición determinada de la molécula de Viroide tuvo un efecto moderado en la acumulación de la circular derivados de Viroide RNAs12. Estas observaciones nos hacen imaginar un método para producir grandes cantidades de recombinante RNAs en bacterias. En este método, se insertan los cDNAs correspondientes a los RNAs de interés en el cDNA ELVd y el ARN quimérico resultante se expresa en e. coli a través de un promotor constitutivo fuerte. Para que el sistema de trabajo, e. coli debe transformarse conjuntamente con un plásmido para expresar la berenjena Arnt Ligasa. La transcripción más que unidad ELVd derivado es procesada por los ribozimas de cabeza de martillo incrustado y los monómeros resultantes con los términos apropiados son reconocidos y circular por el Arnt Ligasa Co expresado. Así, el ARN de interés se inserta en un andamio circular muy estable de la molécula circular de Viroide. Este ARN quimérico recombinante es probablemente más estabilizada dentro de las células de e. coli por la formación de un complejo a través de la interacción con los Arnt Ligasa ribonucleoproteína. Con este método (ver protocolo más adelante), RNA aptámeros, hairpin RNAs y otros RNAs estructurados han sido fácilmente producidos en cantidades de decenas de miligramos por litro de cultivo de e. coli en condiciones de laboratorio regulares y purificada a homogeneidad tomando ventaja de circularidad12.
Durante la investigación los ELVd secuencia y estructura requisitos implicados en el reconocimiento por la berenjena Arnt Ligasa, nos dimos cuenta de que la expresión conjunta de ambas moléculas en el host no e. coli conducido a una inesperado gran acumulación de Viroide circular se forma en las células bacterianas19. Comprendimos que la gran acumulación de Viroide RNA en e. coli probablemente fue consecuencia de expresar Co una molécula de ARN altamente estable, como el r…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas BIO2017-83184-R y BIO2017-91865-EXP desde el Ministerio Español de Ciencia, Innovación y Universidades (cofinanciados fondos FEDER).
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |