분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석
Summary
여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.
Abstract
이 문서는 체 외 섬유 소 혈전 생성 및 분석 하 여 응고 형성 및 구조에 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 단백질의 효과 분석 하 고 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 대 한 방법을 선물 한다. Aβ, Alzheimer의 질병 (광고)에서 신경 녹말 체 집계를 형성, fibrinogen 상호 작용을 보였다. 이 Aβ fibrinogen 상호 작용 구조적으로 비정상적인 fibrinolysis에 저항 하 고 섬유 소 혈전을 만든다. 섬유 소는 혈액 응고에 이상이 Aβ 유도 또한 microinfarcts, 같은 광고 병 리의 뇌혈관 측면에 기여할 수 있습니다 염증, 뿐만 아니라, 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy (CAA). 광고 병리학 neurovascular 적자의 잠재적으로 중요 한 역할을 감안할 때, 유망한 치료 가치는 억제 또는 Aβ fibrinogen 상호 작용을 줄일 수 있는 화합물을 개발. 생체 외에서 메서드는 섬유 소에 의해 응고 형성 평가 될 수 있다 쉽고 체계적으로 치료 화합물 개발을 위한 잠재적으로 유용한 도구입니다. 여기는 섬유 소 혈전의 생성 생체 외에서 Aβ 및 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제의 효과의 분석에 대 한 최적화 된 프로토콜이입니다. 병 탁도 분석 결과 신속 하 고 매우 재현 이며 Aβ fibrinogen 억제제의 다 수의 심사에 대 한 수 있도록 여러 조건을 동시에, 테스트를 사용할 수 있습니다. 이 심사에서 히트 화합물 더 SEM.를 사용 하 여 섬유 소 혈전 아키텍처의 구조 이상 Aβ 유도 개량 하는 능력에 대 한 평가 이러한 최적화 된 프로토콜의 효과 TDI-2760, 최근 확인 된 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제를 사용 하 여 여기 보여 줍니다.
Introduction
Alzheimer의 질병 (광고), 신경 질환 노인 환자에서 인지 감소에 이어지는 주로 비정상적인 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 식, 집계 및 장애인된 클리어런스 neurotoxicity1, 의 결과에서 발생 2. Aβ 집계 및 광고3사이 잘 특징이 협회에도 불구 하 고 근본적인 질병 병 리 정확한 메커니즘은 잘 이해4. 증거를 증가 제안 Aβ6순환 시스템 구성 요소와 직접 상호 작용으로 neurovascular 적자 진행 및 광고5, 심각도에 역할을 재생 합니다. Aβ는 fibrinogen7,8, 또한 광고 환자 및 마우스 모델9,,1011Aβ 예금 localizes와 높은 선호도 상호 작용. 또한, Aβ fibrinogen 상호 작용 fibrinolysis9,12저항 뿐만 아니라 비정상적인 섬유 소 혈전 형성 및 구조, 유도합니다. 광고, 치료 한 치료 가능성 Aβ 및 fibrinogen13,14사이 상호 작용을 억제 함으로써 순환 적자 경감 이다. 우리는, 그러므로, 높은 처리량 검열 및의 약 화학 접근13,14를 사용 하 여 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하는 여러 작은 화합물 확인. Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 효능을 테스트 하려면 우리 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 분석을 위한 두 가지 방법을 최적화: 응고 탁도 분석 결과 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM)14.
병 탁도 분석 결과 섬유 소 혈전 형성 UV 보이는 분광학을 사용 하 여 모니터링을 위한 스트레이트-앞으로 및 빠른 방법입니다. 섬유 소 혈전으로 형태, 빛은 점점 더 흩어져 하 고 솔루션의 탁도 증가 한다. 반대로, Aβ 있으면, 섬유 소 혈전의 구조 변경 및 혼합물의 탁도 감소 된다 (그림 1). 억제 화합물의 효과 병 탁 Aβ 유도 이상에서 복원 가능성에 대 한 평가 될 수 있습니다. 탁도 분석 결과 여러 조건의 신속한 분석에 대 한 수 있으며, 병 모양 및 구조에 제한 된 정보를 제공 합니다. SEM, 솔리드 객체의 지형 전자 조사에 의해 밝혀 수 응고15,16,,1718 의 3 차원 구조 분석 방법의 평가 대 한 Aβ의 존재와 또는 억제 화합물 그 구조9,14변경 합니다. 두 분석 및 SEM는 다양 한 목적을 위해 사용 된 고전적인 실험실 기술, 예, 분 광 광도 법 녹말 체 집계19,20모니터링을 위해 사용 됩니다. 마찬가지로, SEM 분석 파 킨 슨 병 및 thromboembolic 치기 환자21,,2223Alzheimer, 플라즈마에서 형성 된 섬유 소 병 하도 사용 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 재현 하 고 빠른 방식으로 섬유 소 혈전 형성 평가 적합 합니다.
다음 프로토콜 생체 외에서 섬유 소-응고를 모두와 함께 Aβ 없이 준비에 대 한 지침을 제공합니다. 그것은 또한 섬유 소 혈전 형성과 구조에 Aβ의 효과 분석 하는 방법을 자세히 설명 합니다. Aβ-fibrinogen 상호 작용의 억제를 측정 하기 위한이 두 가지 방법의 효과 TDI-2760, 작은 억제 화합물14를 사용 하 여 보여 줍니다. 이 방법을 개별적으로 함께, 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 신속 하 고 간단 분석 허용.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 방법을 섬유 소 혈전 형성에서 체 외에서평가의 재현성 및 빠른 수단을 제공 합니다. 또한, 시스템의 단순은 섬유 소 혈전 형성 및 구조 상대적으로 곧장 앞으로 미치는 Aβ의 해석. 이 연구소의 이전 게시, 그것은 화합물 Aβ fibrinogen 상호 작용13,14을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 테스트를 이러한 분석을 사용할 수 있는 표시 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 마사 노리 가와사키가 즈 요 시 아소, 그리고 마이클 폴 리 트라이 기관 치료제 발견 연구소 (TDI), Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 합성에 대 한 뉴욕 및 그들의 귀중 한 제안에서 감사합니다. 저자는 또한 유용한 토론에 대 한 스 트 릭 랜드 연구소의 회원을 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 NIH 그랜트 NS104386, 질병의 약물 발견 재단, 그리고 로버트 슨 치료 개발 기금 랭에 대 한 NIH 부여 NS50537, 트라이 기관 치료제 디스커버리 연구소 Alzheimer 약물 발견 재단, Rudin 가족 재단과 S.S.의 존 A. 에르난데스
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
Referências
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