Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos
Summary
Descrevemos um in-house projetado em vitro fluxo modelo de câmara, que permite a investigação de adesão bacteriana ao enxerto de tecidos.
Abstract
Várias condutos valvulados e válvulas de stent montado são utilizadas para substituição de válvula de trato (RVOT) de saída do ventrículo direito em pacientes com doença cardíaca congênita. Quando usando materiais protéticos, no entanto, esses enxertos são suscetíveis a infecções bacterianas e várias respostas do hospedeiro.
Identificação de fatores bacterianos e anfitrião que desempenham um papel vital na endovascular aderência dos microorganismos é de importância para compreender melhor a fisiopatologia da superveniência de infecções como a endocardite infecciosa (IE) e desenvolver preventiva estratégias. Portanto, o desenvolvimento de modelos competentes para investigar a adesão bacteriana em condições fisiológicas de cisalhamento é necessário. Aqui, descrevemos o uso de um recém-projetado em vitro perfusão câmara baseado em placas paralelas que permite o estudo da adesão bacteriana aos diferentes componentes dos tecidos de enxerto como expostos a matriz extracelular, células endoteliais e áreas inertes . Esse método combinado com formadoras de Colônia (CFU) unidade de contagem é adequada para avaliar a propensão dos materiais de enxerto para adesão bacteriana sob fluxo. Além disso, o sistema de câmara de fluxo pode ser usado para investigar o papel dos componentes do sangue na adesão bacteriana sob condições de cisalhamento. Temos demonstrado que a fonte de tecido, sua morfologia superficial e especificidade de espécies bacterianas não são os principais fatores determinantes na adesão bacteriana enxertar tecidos usando nosso modelo de perfusão in-house projetado em vitro .
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) emprega uma variedade de estratégias de virulência para burlar o sistema de defesa imunológica host colonizando superfícies biológicas ou não biológicos, implantadas na circulação humana, que leva a graves infecções intravasculares como sepse e IE,1,2,3,4,5. Restos de IE um tratamento importante associado a complicação em pacientes após o implante de válvulas protéticas do coração enquanto factores individuais, contribuindo para o aparecimento de IEare não ainda plenamente compreendido6,7. Sob condições de fluência, as bactérias encontram forças de cisalhamento, que eles precisam superar para aderir ao vaso parede8. Modelos, que permitem estudar a interação entre bactérias e tecido da prótese valvular ou endotélio sob fluxo, são de interesse como eles refletem na vivo situação mais.
Vários mecanismos específicos facilitam a aderência bacteriana às células endoteliais (ECs) e a matriz de subendothelial expostos (ECM) levando a colonização do tecido e maturação de vegetações, sendo essenciais primeiros passos no IE9. Várias proteínas de superfície estafilocócicas ou MSCRAMMs (componentes superfície microbianas reconhecer moléculas da matriz adesiva) têm sido descritos como mediadores de adesão às células do hospedeiro e a proteínas de ECM interagindo com moléculas como a fibronectina, fator de fibrinogênio, colágeno e von Willebrand (VWF)8,10,11. No entanto, tendo em conta a dobrar intra molecular de alguns fatores de virulência, estudadas na maior parte em condições estáticas, muitas dessas interações podem ter diferente relevância nas infecções endovascular na circulação de sangue.
Portanto, apresentamos um in-house projetado em vitro fluxo paralelo-placa modelo de câmara, que permite a avaliação da aderência bacteriana aos diferentes componentes do ECM e ECs no contexto de enxertos de tecido implantado na posição RVOT. O objetivo geral do método descrito neste trabalho é estudar os mecanismos de interação entre as bactérias e os tecidos subjacentes endovascular em condições de fluxo, que estão intimamente relacionados com o ambiente na vivo de patógenos de circulação sanguínea, tais como S. aureus. Esta nova abordagem enfoca a susceptibilidade de superfícies de tecido de enxerto para aderência bacteriana para identificar potenciais fatores de risco para o desenvolvimento do IE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Observações clínicas recentes dar atenção especial a IE como uma complicação em pacientes submetidos a substituição da válvula da RVOT6,13. Disfunção da válvula implantada no IE é o resultado da interação bacteriana com o enxerto endovascular, levando a extensa inflamatória procoagulante reações1,e14. O modelo apresentado romance em vitro permitiu-nos investigar se as diferenç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi patrocinado por uma concessão do fundo de pesquisa KU Leuven (OT/14/097) dada ao RH. TRV foi Postdoctoral Fellow da Fundação de pesquisa FWO – Flandres (Bélgica; Grant Number – 12K0916N) e RH é suportado pela pesquisa clínica fundo de UZ Leuven.
Materials
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | – | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF – ultrapure water – H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides – Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel – surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
Referências
- Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves–assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
