Her beskriver vi isolering af kylling primære bursal celler fra bursa af Fabricius, kultur og infektion i cellerne med smitsomme bursal disease virus og kvantificering af viral replikation.
Smitsomme bursal disease virus (IBDV) er en birnavirus af økonomisk betydning for fjerkræindustrien. Virussen inficerer B celler, der forårsager sygelighed, dødelighed og immunosuppression i inficerede fugle. I denne undersøgelse beskriver vi isolering af kylling primære bursal celler fra bursa af Fabricius, kultur og infektion i celler med IBDV og kvantificering af viral replikation. Tilsætning af kylling CD40 ligand markant øget celleproliferation firedoblet over seks dage af kultur og betydeligt forbedret cellernes levedygtighed. To stammer af IBDV, en cellekultur tilpasset stamme, D78 og en meget ondartet stamme, UK661, replikeres godt i cellekulturer ex vivo . Denne model vil være til nytte ved afgørelsen af, hvordan celler reagerer på IBDV infektion og vil tillade en reduktion i antallet af inficerede fugle bruges i IBDV patogenese undersøgelser. Modellen kan også udvides til at omfatte andre vira og kunne anvendes til forskellige arter af fugle.
Den globale fjerkræindustrien er afgørende for at sikre nok mad til en voksende befolkning. Men immunosuppression er trussel mod fødevaresikkerheden og velfærd for berørte fugle og udgør en afgørende økonomiske udfordring for branchen. Fleste tilfælde af immunosuppression i kyllinger er forårsaget af infektion med immunsupprimerende virus, med de mest ansvarlige for forringer erhvervet immunitet har en tropisme for T- og B-lymfocytter1. I fugle er fleste af B-celler placeret inden for et organ, der er kendt som bursa af Fabricius (BF). B-celler er modtagelige for infektion med flere immunsupprimerende virus, herunder dem, der forårsager lysis, såsom IBDV og Marek’s disease virus (MDV), og dem, der forårsager transformation, såsom aviær kvægleukose virus (ALV) og reticuloendotheliosis virus ( REV).
For at udvikle bedre strategier for at kontrollere disse infektioner, er det afgørende at karakterisere virus interaktion med kylling B celler. Men når B-celler er fjernet fra en fugl, de ikke overlever godt i ex vivo kultur2, hvilket gør det vanskeligt at foretage en grundig analyse af samspillet mellem IBDV med kylling B celler, eller de tidlige begivenheder efter ALV eller REV infektion. Derfor, mange værtssammenspil celle-virus har været studeret i vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Selv om disse undersøgelser er informative, indebærer de brug af inficerede fugle, der lider af sygdomme, der kan være alvorlige.
CD40 ligand er et molekyle, der inducerer B celle spredning11. Efter identifikation af genet kodning kylling CD40L (chCD40L), en opløselig fusion protein var manipuleret, når føjet til mediet, induceret spredning af kylling primære B celler ex vivo12. I 2015 fandtes B celler dyrkes på denne måde at støtte replikering af MDV2 og i 2017, vi og andre konstateret at primære bursal celler stimuleret med chCD40L kunne bruges som en model til at studere IBDV replikering13,14. Her beskriver vi isolation og kultur af kylling primære bursal celler, infektion af celler med IBDV og kvantificering af viral replikation. Selv om vi beskrive metoden i forbindelse med BF, kan dette anvendes til at isolere og kultur celler fra forskellige lymfoide organer.
I denne undersøgelse, vi beskrive den succesfulde kultur af kylling primære bursal celler ex vivo i overværelse af opløselige chCD40L og vise, at disse celler kan støtte replikering af en svækket stamme og en meget ondartet stamme af IBDV. Denne ex vivo model kan bruges til at bestemme, hvordan cellerne reagerer på en IBDV infektion13, som har klare fordele over i vivo og in vitro- undersøgelser.
Når høst af BF, er det afgørende at ikke punktere tarmen for at undgå bakteriel forurening af de isolerede bursal celler. Derudover er det vigtigt at isolere primærelementer hurtigst muligt efter høståret orgel at begrænse celledød. Behovet for at bruge chCD40L er en begrænsning af teknikken; arbejde udført af Soubies et al. viser imidlertid, at anvendelsen af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) at forlænge bursal cellernes levedygtighed i stedet for chCD40L14 kan aktivere model skal vedtages af et større antal laboratorier. Den protokol, der er skitseret ovenfor bestemmer den optimale koncentration af chCD40L empirisk, ved dyrkning af primære B celler i seriefremstillede fortyndet koncentrationen af molekylet og observere celleproliferation og levedygtighed. En potentiel ændring til protokollen kunne være at rense chCD40L molekyle og tilføje en bestemt koncentration til celle kultur medier til at undgå batch til batch variationer.
In vivo studier har vist at følgende IBDV infektion, der er en stigning i udtrykket af gener involveret i pro-inflammatoriske cytokine svar, Type I IFN svar og apoptose i BF5,9,10 . Men efter infektion, der er en tilstrømning af inflammatoriske celler og effektor T celler i BF, som adskiller sig i de gener de udtrykker i forhold til inficerede B-celle population9. Det er derfor vanskeligt at fortolke hvordan inficerede celler reagerer på IBDV. For at løse dette, har nogle forskningsgrupper karakteriseret det transkriptionel svar af celler inficeret med IBDV i kultur16,17,18,19,20. Disse in vitro- undersøgelser har fordelen af veldefinerede MOIs og tid-point efter infektion. Men, in vitro- undersøgelser har typisk været præget enten fibroblast celler16,17,20 eller dendritiske celler18. Mens giver indblik i værtssammenspil celle-IBDV, den nuværende tro er at infektion af B-celler er afgørende for patogenesen af IBDV og derfor, relevansen af data kan ikke være overinterpreted. Før vores ex vivo bursal celle kultur model, havde kun én undersøgelse karakteriseret den cellulære reaktion af B-celler til IBDV infektion19; dog, denne undersøgelse udnyttet en udødeliggjort B cellelinje, som var forvandlet på grund af infektion med ALV, begrænser de konklusioner, der kunne gøres. Derimod modellens ex vivo af IBDV infektion beskrevet her gør det muligt for forskere at bevare fordelene ved in vitro- undersøgelser, som definerede MOIs og tid-point, mens de studerer vekselvirkninger mellem virus og dens relevante vært celle. Som de primære bursal celler er fremstillet af ikke-inficerede BF væv, der er ikke inflammatoriske eller T celler til stede, og vi har demonstreret af flow flowcytometri (ved hjælp af standardbetingelser), at følgende chCD40L stimulation, 97% af cellen befolkningen er positiv for B-celle markør Bu-1 (data ikke vist). 3% af cellerne er Bu-1 negative, det vil være interessant at afgøre, om disse celler blive smittet med IBDV og udforske deres genekspression og bidrag til patogenesen.
Vi forventer, at ex vivo kylling primære bursal celle kultur model kan også udvides til at studere celle-virus værtssammenspil af andre B-celle tropic virus inficerer kyllinger, som ALV eller REV, og kunne også udvides til andre fuglearter ( fx, ænder og kalkuner). Evnen til at kultur primære bursal celler ex vivo også åbner mulighed for at undersøge aspekter af patogenesen og immunosuppression forårsaget af disse vira uden at inficere fugle. Som i vivo undersøgelser forårsage betydelig sygelighed, vil dette have en betydelig indvirkning på udskiftning, raffinement og reduktion af brugen af dyr i forskning.
I Resumé, ex vivo kylling primære bursal celle kultur modellen beskrevet her har potentiale til at udvide forståelsen af hvordan aviær B-celle tropic virus interagere med deres værtsceller samtidig reducere antallet af fugle i in vivo infektion undersøgelser. Teknikkerne, der kan anvendes til flere lymfoide organer, flere vira og potentielt, flere arter af fugle, hvilket gør det til en attraktiv model, der kan bidrage til felterne af aviær virologi og Immunologi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Animal Services-teamet på Pirbright Institut for deres ekspertise i udklækning, opdræt og nedslagtning fugle og ekspertise af Caroline Holt i aseptisk fjernelse bursa af Fabricius. A.B. er finansieret gennem bioteknologien og Biological Sciences Research Council (BBSRC) via give BBS/E/jeg/00001845, K.D. er finansieret gennem BBSRC via studentship BBS/E/jeg/00002115 og A.A. er finansieret gennem det nationale center for den Erstatning, forfining & reduktion af dyr i forskning (NC3Rs) via give NC/R001138/1.
RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56°C for 1 hour |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
0.22µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) – CaCl2 – MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
2-Mercaptoethanol 50mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
100µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |