विकासशील लड़की ऑप्टिक Tectum में स्पर्श सेल प्रवास के दृश्य
Summary
हम electroporation द्वारा tangentially पलायन कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए तरीकों का वर्णन है, और समय के लिए चूक एक फ्लैट में लेबल सेल आंदोलन की इमेजिंग-संस्कृति के क्रम में विकासशील चिकी ऑप्टिक tectum में सेल व्यवहार पलायन कल्पना के लिए .
Abstract
टाइम-चूक इमेजिंग माइग्रेटिंग सेल व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग के बाद, संस्कृति में लेबल कोशिकाओं के आंदोलन वीडियो माइक्रोस्कोपी के तहत दर्ज किया जा सकता है । विकासशील मस्तिष्क में कक्ष माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए, स्लाइस कल्चर का उपयोग सामान्यतः स्लाइस अनुभाग के समानांतर कक्ष माइग्रेशन का पालन करने के लिए किया जाता है, जैसे रेडियल सेल माइग्रेशन. हालांकि, सीमित जानकारी स्लाइस अनुभाग, जैसे स्पर्श कक्ष माइग्रेशन को सीधा कक्ष माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए स्लाईस कल्चर पद्धति से प्राप्त की जा सकती है । यहां, हम समय के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत-चूक इमेजिंग के लिए विकासशील लड़की ऑप्टिक tectum में स्पर्श सेल प्रवास कल्पना । ovo में electroporation द्वारा सेल लेबलिंग का एक संयोजन और सेल कल्चर डालने पर बाद में फ्लैट माउंट संस्कृति क्षैतिज विमान में पलायन सेल आंदोलन का पता लगाने में सक्षम बनाता है । इसके अलावा, हमारे विधि दोनों व्यक्तिगत सेल व्यवहार और लंबी अवधि में कोशिकाओं के एक समूह की सामूहिक कार्रवाई का पता लगाने की सुविधा । इस विधि संभावित फ्लोरोसेंट के अनुक्रमिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है-सूक्ष्म संरचना, तंत्रिका ऊतक या कोशिका विस्थापन में गैर तंत्रिका ऊतक में axonal बढ़ाव सहित लेबल ।
Introduction
सेल प्रवास के अध्ययन लाइव इमेजिंग की तकनीक को आगे बढ़ाने के साथ प्रगति कर रहा है । फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग के बाद, एक संस्कृति डिश में या vivo में लेबल कोशिकाओं के लौकिक आंदोलन वीडियो माइक्रोस्कोपी के तहत दर्ज किया जा सकता है । तंत्रिका विकास के अध्ययन में, प्रवास कोशिकाओं या लंबी axons के रूपात्मक परिवर्तन समय-चूक इमेजिंग का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है । प्रभावी इमेजिंग के लिए, यह फ्लोरोसेंट सेल लेबलिंग और ऊतक तैयारी, प्रयोग और विश्लेषण के उद्देश्य पर आधारित के लिए एक उपयुक्त विधि लागू करने के लिए आवश्यक है । विकासशील मस्तिष्क में कक्ष माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए, स्लाइस कल्चर का उपयोग सामान्यतः स्लाइस अनुभाग के समानांतर कक्ष माइग्रेशन का अवलोकन करने के लिए किया जाता है, जैसे रेडियल सेल माइग्रेशन1,2,3. स्लाइस संस्कृति प्रणाली भी स्पर्श सेल प्रवास4,5का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह उन मामलों में दिशात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है जहां कोशिकाओं टुकड़ा अनुभाग के लिए सीधा फैलाने ।
ऑप्टिक tectum एक multilayered संरचना से बना है, भ्रूण के विकास के दौरान रेडियल और स्पर्श सेल प्रवास द्वारा गठित । Tectal परत गठन वेंट्रिकुलर क्षेत्र से postmitotic ंयूरॉन अग्रदूत कोशिकाओं के रेडियल प्रवास पर मुख्य रूप से निर्भर करता है, और उनके परतों में अंतिम गंतव्य वेंट्रिकुलर क्षेत्र6में उनके जंम की तारीख के साथ संबद्ध । के रूप में स्पर्श प्रवास के लिए, हम पहले एक विकासशील लड़की ऑप्टिक tectum में मध्य और सतही परतों में प्रवास के दो धाराओं की सूचना दी । E6-E8 के दौरान बीच परतों में, एक लंबे समय अग्रणी प्रक्रिया और एक पतली पीछे की प्रक्रिया के साथ द्विध्रुवी कोशिकाओं को पृष्ठीय या fasciculus tectal efferent कि रन axons-dorso7के axon ventrally साथ ventrally माइग्रेट । इस axophilic प्रवास के बाद, कोशिकाओं multipolar न्यूरॉन्स गहरी परतों में स्थित में अंतर. E7-E14 के दौरान सतही परतों में, माइग्रेट कक्ष क्षैतिज रूप से एक branched अग्रणी प्रक्रिया को सुधारना और कई दिशाओं में स्कैटर द्वारा फैलाएं8। माइग्रेशन फैलाने के बाद, उत्तरार्द्ध कोशिकाएँ अंततः विभिन्न morphologies के सतही न्यूरॉन्स में अंतर करती हैं. दोनों ही मामलों में, एक फ्लैट माउंट संस्कृति pial सतह के लिए सेल आंदोलन समानांतर निरीक्षण करने के लिए कुशल है ।
यहां, हम समय चूक इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद के लिए विकासशील लड़की ऑप्टिक tectum7,8में स्पर्श सेल प्रवास कल्पना । ovo मेंelectroporation द्वारा सेल लेबलिंग का संयोजन, और सेल कल्चर डालने पर बाद में फ्लैट-माउंट कल्चर को माइग्रेट सेल मूवमेंट और माइग्रेशन दिशा का पता लगाने में सक्षम बनाता है । इस विधि के लक्ष्य को लंबे समय में दोनों व्यक्तिगत कोशिका व्यवहार और क्षैतिज विमान में कोशिकाओं के एक समूह की सामूहिक कार्रवाई की खोज की सुविधा है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित सतही परतों6,8में सेल प्रवास का पता लगाने के लिए अनुकूलित है । यह मध्य परत प्रवासन धाराओं ( 5फिल्म )6,7का पता लगाने के लिए लागू ह?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर 15K06740 को सपोर्ट किया गया Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
Referências
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Biologia do Desenvolvimento. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
