Visualisering av tangentiell celle migrasjon i utviklingsland Chick fiberoptisk Tectum
Summary
Vi beskriver metodene for fluorescerende merking tangentially overføre celler av electroporation og for tidsinnstilt bildebehandling merket celle bevegelsen i en flat-mount kultur for å visualisere migrere celle atferd i den utvikle chick fiberoptisk tectum .
Abstract
Tidsinnstilt bildebehandling er en kraftig metode for å analysere migrere celle atferden. Etter fluorescerende celle merking, kan bevegelsen av merket cellene i kultur registreres under video mikroskopi. For å analysere celle migrasjon i utvikle hjernen, er stykket kultur vanlig å observere celle migrasjon parallelt delen skive som radial celle migrasjon. Imidlertid kan begrenset informasjon fås fra skive kultur metoden å analysere celle migrasjon vinkelrett delen skive som tangentiell celle migrasjon. Her presenterer vi protokollene for time-lapse tenkelig å visualisere tangentiell celle migrasjon i utviklingsland chick fiberoptisk tectum. En kombinasjon av cellen merking av electroporation i ovo og en påfølgende flat-mount kultur på celle kultur innsatsen kan oppdagelsen av migreringen celle bevegelse vannrett. Dessuten Letter vår metode oppdagelsen av både enkeltcelle atferd og kollektiv handling av en cellegruppe på lang sikt. Denne metoden kan potensielt brukes for å følge endringen av fluorescerende-merket mikro-strukturen, inkludert axonal forlengelse i nevrale vev eller celle forskyvning i ikke-nevrale vev.
Introduction
Studiet av celle migrasjon har gått etter med fremmarsj teknikk for live bildebehandling. Etter fluorescerende celle merking, kan timelige bevegelsen av merkede celler i en kultur parabol eller i vivo registreres under video mikroskopi. I studiet av neural utvikling, er morfologiske endringene av migrering celler eller elongating axons analysert ved hjelp av tidsinnstilt bildebehandling. For effektiv bildebehandling er det viktig å bruke en egnet metode for fluorescerende celle merking og vev forberedelse, basert på eksperimentet og analyse. For å analysere celle migrasjon i utvikle hjernen, er slice kultur vanligvis brukt til å observere celle migrasjon parallelt delen skive som radial celle migrasjon1,2,3. Skive kultur-systemet brukes også for å oppdage tangentiell celle migrasjon4,5, men det er ikke egnet for retningsbestemt analyse i tilfeller der cellene spre vinkelrett til delen skive.
Fiberoptisk tectum består av en flerlags struktur, dannet av radial og tangentiell celle migrasjon under embryonale utviklingen. Tectal lag formasjonen avhenger hovedsakelig radial migrering av postmitotic neuronal forløper celler fra sonen ventrikkel og deres endelig destinasjon i lagene korrelerer med sine fødselsdato i ventrikkel sonen6. Som for tangentiell migrasjon rapportert vi tidligere to strømmer av overføringer i midten og overfladiske lagene i en utvikling chick fiberoptisk tectum. I de midterste lag under E6-E8 overføre bipolar cellene med en lang ledende prosess og en tynn etterfølgende prosessen på ryggen eller ventrally langs axon fasciculus av tectal efferent axons som kjører dorso-ventrally7. Etter denne axophilic overføring skille cellene i multipolar nevroner i de dype lag. I overfladisk lagene under E7-E14 spre overfører cellene vannrett ved å reformere en forgrenet ledende prosessen og scatter i flere retninger8. Etter spre migrasjon, skille sistnevnte cellene til slutt ut overfladisk nevroner i ulike morphologies. I begge tilfeller er en flat-mount kultur effektivt å observere celle bevegelse parallelt pial overflaten.
Her presenterer vi en protokoll for time-lapse tenkelig å visualisere tangentiell celle migrasjon i utviklingsland chick fiberoptisk tectum7,8. Kombinasjonen av cellen merking på electroporation i ovo, og en påfølgende flat-mount kultur på celle kultur innsatsen kan påvisning av overfører celle bevegelse og migrasjon retning. Målet med denne metoden er å lette oppdagelsen av både enkeltcelle atferd i langsiktig og kollektiv handling av en gruppe celler vannrett.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor er optimalisert for å oppdage celle migrasjon i overfladisk lag6,8. Det gjelder for å oppdage midterste laget migrasjon bekker (film 5)6,7, bare ved å flytte tidspunktet for electroporation (E5.5 til E4.5) og utbruddet av kultur og imaging (E7.0 til E6.0).
Presentert prosedyren består av celle merking av elect…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI bevilgning nummer 15K 06740 til Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
Referências
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Biologia do Desenvolvimento. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
