Визуализация тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические Tectum
Summary
Мы описываем методы для люминесцентные маркировки вскользь мигрирующих клеток путем электропорации и для покадровой изображений меткой ячейки движения в квартиру гора культуры для того, чтобы визуализировать миграции клеток поведение в развивающихся куриных оптические tectum .
Abstract
Промежуток времени изображений является мощный метод для анализа миграции поведение клеток. После люминесцентные клеток маркировки движение помеченных клеток в культуре может быть записан под видео микроскопии. Для анализа миграции клеток развивающегося мозга, ломтик культуры обычно используется для наблюдать миграции клеток параллельно срез секции, например радиальные клеток миграции. Однако ограниченную информацию можно получить из метода slice культуры для анализа миграции клеток, перпендикулярно срез секции, такие как тангенциальная клеток миграции. Здесь мы представляем протоколы для покадровой изображений визуализировать тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические tectum. Сочетание клетки маркировки электропорации в ovo и последующие культуры плоским гора на вкладыше культуры клеток позволяет обнаружение перенос клеточного движения в горизонтальной плоскости. Кроме того наш метод облегчает обнаружение как поведение отдельной клетки, так и коллективных действий группы клеток в долгосрочной перспективе. Этот метод потенциально может применяться для обнаружения последовательные изменения люминесцентные меченых микро-структуры, включая аксональное удлинение в нейронной ткани или клетки перемещения в не нервной ткани.
Introduction
Изучение миграции клеток развивается с развивающейся техникой живых изображений. После люминесцентные клеток маркировки височной движение помеченных клеток в культуре блюдо или в естественных условиях может быть записан под видео микроскопии. В изучении нейронных развития морфологические изменения миграции клеток или удлинения аксоны были проанализированы с использованием промежуток времени визуализации. Для эффективной обработки изображений, важно, чтобы применить подходящий метод подготовки люминесцентные клеток тканей и маркировки, основанные на Цель эксперимента и анализ. Для анализа миграции клеток развивающегося мозга, ломтик культуры часто используются для наблюдать миграции клеток параллельно срез секции, например радиальные клеток миграции1,2,3. Срез культуры система также используется для обнаружения тангенциальная клеток миграции4,5, но это не подходит для направления анализа в тех случаях, где клетки разогнать перпендикулярный срез секции.
Оптоволоконный tectum состоит из многослойной структуры, образованные радиального и тангециального клеток миграции во время эмбрионального развития. Формирование тектальный слоя зависит главным образом от радиального миграции клеток-постмитотических нейрональных предшественников из желудочков зоны, и их конечного назначения в слоях коррелирует с даты их рождения в Вентрикулярная зона6. Что касается тангенциальная миграции мы сообщалось ранее двух потоков миграции в средних и поверхностных слоев в развивающихся куриных оптические tectum. В средних слоях во время E6-E8 биполярный клетки с давно ведущих процесс и тонкие завершающие процесс миграции дорзально или вентрально вдоль аксона fasciculus тектальный эфферентной аксонов, использующих dorso вентрально7. После этого axophilic миграции клетки дифференцироваться в многополярном нейроны, расположенные в глубоких слоях. В поверхностных слоях во время E7-E14 мигрирующих клеток расходятся горизонтально путем реформирования разветвленной ведущих процесс и разброс в несколько направлений8. После диспергирования миграции, последний клетки в конечном итоге дифференцироваться в поверхностных нейроны различных морфологии. В обоих случаях с плоским гора культура эффективно соблюдать клеточного движения параллельно сетчаточных поверхности.
Здесь мы представляем собой протокол для покадровой imaging для визуализации тангенциальная клеток миграции в оптические tectum развивающихся куриных,7,,8. Сочетание клетки маркировки электропорации в ovo, и последующие культуры с плоским гора на вкладыше культуры клеток позволяет обнаружение перенос направления движения и миграции клеток. Цель этого метода является для облегчения обнаружения поведения как отдельной ячейки в долгосрочной перспективе и коллективных действий группы клеток в горизонтальной плоскости.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные выше протокол оптимизирован для обнаружения миграции клеток в поверхностных слоях6,8. Это применимо для обнаружения среднего уровня миграции потоков (фильм 5)6,7, просто перенос сроков электропо…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI Грант номер 15K 06740 для Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
Referências
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Biologia do Desenvolvimento. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
