Эндотоксин деятельности Анализ для обнаружения эндотоксемии всей крови у критически больных пациентов
Summary
Настоящим мы представляем протокол для измерения у постели эндотоксинной активности образцов крови человека. Эндотоксин активность анализ простой тест для выполнения и может быть полезным биомаркером в критически больных пациентов с сепсисом.
Abstract
Липополисахарид, также известный как эндотоксин, является фундаментальным компонентом грамотрицательных бактерий и играет решающую роль в развитии сепсиса и септического шока. Раннее выявление инфекционного процесса, который быстро превращается в критическое заболевание, может привести к более быстрому и интенсивному лечению, что потенциально может привести к улучшению исходов для пациентов. Эндотоксинная активность (ЕА) можно использовать у постели в качестве надежного биомаркера системной эндотоксемии. Обнаружение повышенных уровней эндотоксинной активности неоднократно было показано, что связано с повышенной тяжести заболевания у пациентов с сепсисом и септическим шоком. Ассес быстро и легко выполнить. Кратко, после отбора проб, аликвот цельной крови смешивается с антиэндотоксином антитела и с добавлением LPS. Эндотоксинная активность измеряется как относительный окислительный всплеск загрунтованных нейтрофилов, обнаруженный хемиолюминесценцией. Выход асссея выражается по шкале от 0 (отсутствует) до 1 (максимальный) и классифицируется как “низкий” (0,4 единицы), “промежуточный” (0,4-0,59 единицы) или “высокий” (0,6 единицы). Подробная методология и обоснование реализации асссеа Е.А. представлены в данной рукописи.
Introduction
Липополисахарид (LPS), также известный как эндотоксин, является ключевым компонентом мембранной структуры грамположительных (GN) бактерий. Он составляет около 10% клеточной стенки, будучи жизненно важным для внешней целостности мембраны и гомеостаза. Кроме того, это мощный активатор врожденнойиммунной системы хозяина 1,2.
В пробирке воздействие врожденных клеток иммунной системына LPS приводит к изменениям в экспрессии нескольких генов 3. Введение очень небольших количеств ЛПС у здоровых добровольцев человека вызывает каскад острого системного воспаления, в то время как сепсис и септический шок могут возникнуть при более высоких концентрациях эндотоксина4,5.
Сепсис является опасным для жизни состоянием, которое, если не быстро распознается, может привести к многоорганной недостаточности и смерти. Пациенты септиками должны лечиться своевременно, с агрессивной реанимацией, адекватной антибиотикотерапией, оптимальным контролем источника и быстрыми стратегиями поддержки органов. Диагноз этиологии сепсиса в первую очередь основан на клиническом признании и культурном обнаружении патогенов6. Тем не менее, результаты микробных культур может занять до 48 ч и являются неубедительными в 30% случаев7. Ранняя идентификация и вмешательство могут привести к улучшению исходов для пациентов. У пациентов, у которых подозревается сепсис, решения часто принимаются на основе физиологических и биохимических параметров, без явных признаков эндотоксемии.
Измерение эндотоксинной активности (ЕА) может быть получено с помощью коммерческого анализа (см. Таблицаматериалов) в цельной крови. Он может быть использован в качестве биомаркера системной эндотоксемии для раннего расслоения тяжести заболевания, особенно у пациентов с риском развития септического шока8. Ассес был использован для руководства Полимиксин B гемоперфузионной терапии в недавно опубликованном двойном слепом рандомизированно-контролируемого клинического испытания у пациентов с септическим шоком9. У тяжелобольных пациентов исследование MEDIC показало, что повышенные уровни Е.А. связаны с множественной дисфункцией органов, продолжительностью пребывания в отделении интенсивной терапии (ICU) и смертностью10.
Различные анализы были разработаны для обнаружения эндотоксина. Анализ Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) либо в качестве гель-сгустка, мутбидиметрического или хромогенного теста, до сих пор был наиболее часто принятым для оценки эндотоксина сыворотки. Он основан на способности эндотоксина вызывать коагуляцию гемолимфа краба подковы, Limulus polyphemus. Тем не менее, этот ассес имеет некоторые ограничения с точки зрения специфики. В частности, он также может быть активирован микробных продуктов, помимо эндотоксина, таких как компоненты грибковой клеточной стенки, и он может быть ингибирован различными белками плазмы человека11.
В течение последнего десятилетия измерение Е.А. было разработано и проверено в качестве биомаркера циркулирующей эндотоксемии. По сравнению с тестом LAL, EA быстрее и проще внедряется в клинических условиях. Кроме того, было показано, что более точным, чем LAL в цельной крови, с повышенной чувствительностью и специфичностью, как в пробирке и in vivo12.
Несмотря на его первоначальную реализацию в качестве раннего диагностического инструмента для быстрого выявления бактерий GN как сепсиса возбудительов, уровень Е.А. также был изучен как биомаркер тяжести заболевания. В этом контексте было показано, что особенно полезно для оценки состояния гипоперфузии из-за продолжающихся критических заболеваний, таких как септический шок или синдром после остановки сердца13. Совсем недавно, с момента разработки систем гемоочищения, положительный результат Е.А. также был предложен в качестве инструмента скрининга для точного выявления потенциальных кандидатов на такую терапию14. Недавно мы провели ретроспективное исследование по распространенности и клинической значимости ранних высоких уровней ЕА у 107 пациентов с септическим шоком. В соответствии с другими последними результатами, мы обнаружили, что Е.А. является перспективным маркером тяжести заболевания у пациентов с септическим шоком15.
Цель настоящей рукописи состоит в том, чтобы описать метод выполнения анализов Е.А., либо у постели, либо в лаборатории, и описать его потенциальное использование в репрезентативном сценарии септического шока. Этот метод может обнаружить активность LPS путем измерения повышенного окислительного всплеска в нейтрофилов после их грунтовки комплексами антиэндотоксина антитела и LPS. Повышенный респираторный всплеск обнаруживается хемилюминометром, а количество излучаемого света считается пропорциональным количеству эндотоксина в образце крови. Анализ требует нескольких реагентов, занимает около 30 минут для выполнения и использует всего лишь 40 зл цельной крови12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Септический шок по-прежнему в настоящее время связано со смертностью выше, чем 40%, хотя этот показатель варьируется в соответствии с рассмотренными докладами16. Необходимость новых и лучших биомаркеров пропагандируется большинством экспертов в области, с тем чтобы помочь ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Паоло Брагане и Лизу Матиасен, доктор скую степень, за их обзор методологии протокола анализа. Дарио Уинтертон, MD, оказал существенную помощь в просмотре рукописи для владения английским языком.
Materials
| EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package with 20 tests + 1 quality control |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
| Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |
Referências
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
- Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).
- Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
- Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).
- Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).
- Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).
- Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).
- Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6 (4), 342-348 (2002).
- Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).
- Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218 (2014).
- Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
- Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).
- Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).
- Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).
- Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16 (3), (2012).
- Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10 (7), (2015).
- Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology?. Annals of Surgery. 218 (3), 321 (1993).
- Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).
- Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).
- Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42 (3), 521-528 (2014).
- Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28 (5), 524-529 (2007).
