Samtidige undersøgelse af ansættelse af monocyt delpopulationer Under Flow In Vitro
Summary
Vi præsenterer her, en integreret protokol, der måler monocyt delpopulation handel under flow in vitro-ved brug af specifikke overflade markører og konfokal Fluorescens mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at udforske sekventielle rekruttering trin samt for at profilere andre leukocyt undertyper ved hjælp af andre specifikke overflade markører.
Abstract
Ansættelse af monocytter fra blodet til målrettede perifere væv er afgørende for den inflammatoriske proces under vævsskade, tumor udvikling og autoimmune sygdomme. Dette er lettet gennem en proces med opsamling fra frie strøm på den luminale overflade af aktiverede endotelceller, efterfulgt af deres vedhæftning og transendothelial migration (transmigration) i de underliggende berørte væv. Men de mekanismer, der understøtter de privilegerede og kontekst-afhængige rekruttering af monocyt delpopulationer er stadig ikke fuldt forstået. Derfor har vi udviklet en metode, der giver mulighed for ansættelse af forskellige monocyt delpopulationer samtidig visualiseret og målt under flow. Denne metode, baseret på time-lapse Konfokal billeddannelse, giver mulighed for en entydig skelnen mellem vedhængende og transmigrated monocytter. Her beskriver vi, hvordan denne metode kan bruges til at studere samtidigt rekruttering kaskade af pro-angiogene og ikke-angiogene monocytter in vitro. Denne metode kan endvidere udvides til at studere de forskellige trin i ansættelse af op til tre monocyt populationer.
Introduction
Monocytter udgør en fagocyterende komponent af medfødt immunitet, der er nødvendig til bekæmpelse af patogener, rydde op beskadiget væv, angiogenese og Patofysiologi af mange sygdomme herunder kræft1,2,3 . Monocytter er knoglemarv-afledte celler sammensat af heterogene delpopulationer, der cirkulerer i blodet, men kan ansættes til stedet for betændelse i perifere væv gennem specifikke molekylære mekanismer. Rekruttering kaskader af monocytter, som for leukocytter i almindelighed, implicerer forskellige trin herunder opsamling, rullende, kravle, anholdelse, transendothelial migration (transmigration) og migration gennem karvæggen (basalmembranen og vægmaleri celler)4. Disse trin involverer primært betændelse-induceret molekyler på i endothelial luminale overflade som selectins, glycoprotein ligander, kemokiner, intercellulære og junctional adhæsionsmolekyler, og deres receptorer på leukocytter såsom selectin ligander og integriner. Menneskehandel veje gennem enten i endothelial celle vejkryds (paracellular) eller i endothelial cellen kroppen (transcellular) kan bruges af leukocytter for at krydse endotel barriere5. Mens monocytter har historisk dokumenteret for at transmigrate gennem transcellular ruten, er potentielle forskelle i deres vandrende pathway blevet foreslået som monocytter er ikke længere betragtes som en homogen celle population. Nu bliver det klart, at monocyt mangfoldighed kan defineres af hver af deres forskelle og fællestræk, med hensyn til deres særprægede ekstravasation kaskader3,6. Derfor, for at forskelsbehandle utvetydigt monocyt delpopulationer, er det afgørende at visualisere og fænotype funktionsmåden for hver af disse forskellige delpopulationer under rekruttering proces.
Monocytter fra menneskelige, svin, rotter og mus blev opdelt i fænotypiske delpopulationer med visse tilskrives funktioner og specifikke vandrende adfærd7,8,9. For eksempel, hos mennesker, kan monocytter inddeles i tre undergrupper baseret på deres overflade udtryk af CD14, en coreceptor for bakteriel LPS og CD16, Fc-gamma receptor III. Humane monocyt delpopulationer omfatter klassisk CD14+CD16–, mellemliggende CD14+CD16+ og ikke-klassisk CD14dimCD16+ celler,6,9. Den klassiske CD14+CD16– monocytter blev vist sig at være primært inflammatoriske boer puljen af CD16+ monocytter fandtes kollektivt for at præsentere TIE2 udtryk og proangiogenic funktion10. Konsekvent, endotel celle stimulation med inflammatoriske cytokiner såsom menneskelige tumor nekrose faktor (TNF) α eller interleukin (IL-1) beta (konventionelle betændelse) er tilstrækkelig til at udløse den komplette rekruttering af klassisk CD14+CD16 – monocytter. Samtidige handlinger af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) A og TNFα (angiogene faktorer-drevet betændelse) er dog forpligtet til at provokere CD16 transmigration+ proangiogenic pulje af monocytter3. Historisk, den traditionelle Transwell system under statiske betingelser, parallelle plade flow kammer og µ-slide flow kamre er blevet anvendt til kvantitativt analysere rekruttering af én leukocyt befolkning på et tidspunkt in vitro-11 ,12,13. Mens disse protokoller er blevet godkendt, betragtes en mere robust metode, der tillod en simultan analyse af flere monocyt delpopulationer mere indsigtsfulde. Sådanne metoder skal redegøre for flere interaktioner og de forskellige frekvenser af hver respektive befolkning og også give en mekanistisk forståelse af ligheder og forhold for rekruttering cascades, der definerer hver monocyt delmængde.
Her præsenterer vi en metode baseret på de time-lapse billeddannelse af monocyt rekruttering under flow, som tillader den vandrende kaskader af forskellige monocyt delpopulationer undersøges samtidigt ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Denne metode integrerer visse kritiske funktioner, der efterligner endotel celle betændelse samt Hæmodynamik af cirkulerende monocytter i post kapillær venules, den vigtigste placering af leukocyt ansættelse in vivo. Den foreslåede metode bruger menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVEC), der genereres gennem en veletableret protokol af isolation fra menneskelige umbilical snore. Denne kliniske ressource har fordelen at være nemt tilgængelig som et biologisk biprodukt, samtidig også giver et rimeligt udbytte i endothelial celler, der kan isoleres fra navlestrengen venen. Vi brugte også fluorescerende farvestoffer og immunfluorescens for at skelne mellem forskellige cellulære komponenter, og konfokal mikroskopi til utvetydigt definerer monocyt positionering (luminale vs abluminal) over tid. Protokollen præsenteres her er blevet udviklet til samtidig foranstaltning transmigration niveauer af monocyt delpopulationer. Desuden skal det bemærkes, at denne metode kan udvides til at studere andre leukocytter delpopulationer og rekrutteringsprocesser ved brug af forskellige biomarkører og mærkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi en metode beskriver en undersøgelse af hvordan monocyt delpopulationer transmigrate gennem den betændte endotel éncellelag. Den omtalte metode brugt Konfokal mikroskopi i stedet for fasekonstrastmikroskopi, som også bruges til at studere monocyt rekruttering under flow3,11,19. En væsentlig fordel ved hjælp af Konfokal mikroskopi for time-lapse imaging er evnen til at utvetydigt forskelsbehandle transmigr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Paul Bradfield for manuskript læsning og feedbacks. A. S. modtaget økonomisk støtte fra Sir Jules Thorn velgørende oversøiske Trust Reg.,
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
Referências
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
