Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.
Abstract
Die Rekrutierung von Monozyten aus dem Blut zu gezielten peripheren Geweben ist entscheidend für den Entzündungsprozess bei Gewebeverletzungen, Tumorentstehung und Autoimmunerkrankungen. Dies wird durch einen Prozess der Aufnahme von freien Informationsfluss auf der luminalen Oberfläche des aktivierten Endothelzellen, gefolgt von ihrer Haftung und Transendothelial Migration (Seelenwanderung) in das darunter liegende Gewebe der betroffenen erleichtert. Allerdings sind die Mechanismen, die die bevorzugte und Kontext-abhängige Einstellung von Monocyte Subpopulationen unterstützen noch nicht vollständig verstanden. Daher haben wir eine Methode entwickelt, die ermöglicht die Einstellung von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig visualisiert und unter Strom gemessen werden. Diese Methode, basierend auf Time-Lapse confocal Imaging ermöglicht die eindeutige Unterscheidung zwischen Anhänger und transmigrated Monozyten. Hier beschreiben wir, wie diese Methode verwendet werden kann, um gleichzeitig die Rekrutierung Kaskade von Pro-angiogenen und nicht-angiogenen Monozyten in-vitro-Studie. Darüber hinaus kann diese Methode erweitert werden, um die verschiedenen Schritte der Rekrutierung von bis zu drei Monocyte Populationen zu studieren.
Introduction
Monozyten bilden eine phagocytic Komponente der angeborenen Immunität, die wichtig für die Bekämpfung von Krankheitserregern, Bereinigen von beschädigtem Gewebe, Angiogenese und der Pathophysiologie von vielen Krankheiten, einschließlich Krebs1,2,3 . Monozyten sind Knochenmark gewonnenen Zellen bestehend aus heterogener Subpopulationen, die im Blut zirkulieren, aber können an den Ort der Entzündung im peripheren Gewebe durch spezifische molekulare Mechanismen rekrutiert werden. Die Rekrutierung Kaskaden von Monozyten, wie bei Leukozyten impliziert in der Regel verschiedene Schritte einschließlich der Erfassung, Rollen, krabbeln, Verhaftung, Transendothelial Migration (Seelenwanderung) und Migration durch die Gefäßwand (Basalmembran und Wandbild Zellen)4. Diese Schritte beinhalten vor allem Entzündungen-induzierte Moleküle auf der endothelialen luminalen Oberfläche z. B. Selectins Glykoprotein Liganden, Chemokine, Knoten und interzelluläre Adhäsionsmoleküle und ihre Rezeptoren auf Leukozyten wie Selektin-Liganden und Integrine. Handel Wege über entweder die Endothelzellen Kreuzungen (parazellulär) oder über die endotheliale Zellkörper (transzelluläre) lässt sich die endotheliale Barriere5überqueren von Leukozyten. Während Monozyten historisch dokumentiert worden sind, um durch die transzelluläre Route transmigrate wurden mögliche Unterschiede in ihren wandernden Weg da Monozyten nicht mehr als eine homogene Zellpopulation gelten vorgeschlagen. Es wird jetzt klar, dass Monocyte Vielfalt kann von jedem ihrer Unterschiede und Gemeinsamkeiten definiert werden, in Bezug auf ihre unverwechselbare Extravasation Kaskaden3,6. Daher, um eindeutig zwischen Monocyte Subpopulationen unterscheiden, ist es entscheidend, zu visualisieren und Phänotyp das Verhalten der einzelnen von diesen verschiedenen Subpopulationen während der Rekrutierung verarbeiten.
Monozyten von Mensch, Schwein, Ratte und Maus waren unterteilt in phänotypischen Subpopulationen mit bestimmten zugeschriebenen Funktionen und spezielle wandernden Verhaltensweisen7,8,9. Beispielsweise können beim Menschen, Monozyten drei Teilmengen basierend auf deren Oberflächenexpression von CD14, ein Coreceptor für bakterielle Lipopolysaccharid und CD16, den Fc-Gamma-Rezeptor III unterteilt werden. Menschliche Monocyte Subpopulationen gehören klassische CD14+CD16–, Mittelstufe CD14+CD16+ und nicht-klassischen CD14dimCD16+ 6,9Zellen. Die klassische CD14+CD16– Monozyten erwiesen sich vor allem entzündliche während der Pool von CD16+ Monozyten fanden sich kollektiv TIE2 Ausdruck und Proangiogenic Funktion10zu präsentieren. Konsequent, Endothelzellen Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen wie menschliche Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α oder Interleukin (IL-1) Beta (konventionelle Entzündung) ist ausreichend, um die komplette Einstellung von klassischen CD14 auslösen+CD16 – Monozyten. Simultane Aktionen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) A und TNF (angiogenen Faktoren angetrieben Entzündung) sind jedoch erforderlich, um die Seelenwanderung die CD16 provozieren+ Proangiogenic Pool von Monozyten3. Historisch gesehen, das traditionelle Transwell-System unter statischen Bedingungen, die parallelen Platten Strömungsraum und die µ-Folie Fluss Kammern wurden verwendet, um quantitativ zu analysieren, die Rekrutierung von Leukozyten eine Bevölkerung an eine Zeit in-vitro-11 ,12,13. Während diese Protokolle validiert wurden, würde eine robustere Methode, die erlaubt die simultane Analyse von mehreren Monocyte Subpopulationen einsichtsvolleren betrachtet werden. Solche Methoden müssen mehrere Interaktionen und die unterschiedlichen Frequenzen jedes jeweiligen Bevölkerung ausmachen und auch bieten ein mechanistisches Verständnis für die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten für die Rekrutierung-Kaskaden, die jede Monocyte definieren Teilmenge.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode basiert auf der Time-Lapse Bildgebung der Monocyte Rekrutierung durch fließen, wodurch die wandernden Kaskaden von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig untersucht werden, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Diese Methode integriert bestimmte kritische Funktionen, die Endothelzellen Entzündung sowie die Hämodynamik des zirkulierenden Monozyten in Post-Kapillaren Venolen, am Hauptstandort der Leukozyten Rekrutierung in vivo zu imitieren. Die vorgeschlagene Methode verwendet menschliche Nabelader Endothelzellen (HUVECS), die durch ein etabliertes Protokoll der Isolation von menschlichen Nabelschnur erzeugt werden. Diese klinische Ressource hat den Vorteil des Seins leicht zugänglich als Nebenprodukt biologischer, während auch eine vernünftige Rendite von Endothelzellen, die von der Nabelader isoliert werden können. Wir auch zur Fluoreszenz-Farbstoffen und Immunfluoreszenz Unterscheidung der verschiedenen zellulären Komponenten und konfokalen Mikroskopie eindeutig definieren Monocyte Positionierung (luminalen vs. abluminalen) im Laufe der Zeit. Die hier vorgestellten Protokoll wurde gleichzeitig messen die Seelenwanderung Ebenen der Monocyte Subpopulationen entwickelt. Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass diese Methodik auf um andere Leukozyten-Subpopulationen und Einstellungsverfahren zu studieren erweitert werden kann, durch Einsatz von verschiedenen Biomarker und Kennzeichnung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier berichten wir über eine Methode, die eine Studie über wie Monocyte Subpopulationen durch die entzündeten endotheliale Monolage transmigrate Detaillierung. Die besprochene Methode verwendet konfokalen Mikroskopie statt Phasenkontrast-Mikroskopie, die genutzt wird um Monocyte Rekrutierung unter Strömung3,11,19zu untersuchen. Ein großer Vorteil der konfokalen Mikroskopie für Zeitraffer-Aufnahmen mit ist die Fähigkeit zu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Paul Bradfield Manuskript lesen und Feedbacks. A. S. erhielt finanziellen Unterstützung von der Sir Jules Thorn gemeinnützige Overseas Trust reg.,
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
Referências
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