Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon
Summary
Bu da çalışmanın bir zebra balığı embriyo modeli içinde vivo görselleştirme ve enfeksiyonu floresans mikroskobu göre zaman içinde biomaterial ilgili intravital analizi için açıklar. Bu model içinde vivo biomaterial ilişkili enfeksiyonların çalışmak için fare modelleri gibi memeli hayvan modelleri tamamlayan gelecek vaat eden bir sistemdir.
Abstract
Enfeksiyonu (BAI) biomaterial ilgili Biyomalzeme/tıbbi cihazlar başarısızlığın önemli bir nedenidir. Staphylococcus aureus BAI önemli patojenler biridir. Fare modelleri pahalı ve zaman alıcı ve bu nedenle yüksek üretilen iş analizi için uygun değildir gibi geçerli deneysel BAI memeli hayvan modelleri. Böylece, roman hayvan modelleri BAI içinde vivo soruşturma için tamamlayıcı sistemler olarak istenilen. Mevcut çalışma, zebra balığı embriyo model içinde vivo görselleştirme ve floresan mikroskopi üzerinde dayalı Biyomalzeme huzurunda bakteriyel enfeksiyon intravital çözümleme geliştirmek amaçlanmıştır. Buna ek olarak, provoke makrofaj yanıt incelenmiştir. Bu amaçla, floresan protein ifade S. aureus ve transgenik zebra balığı embriyo onların makrofajlar floresan proteinler ifade kullanılan ve bakteriler tek başına veya birlikte mikroküreler kas içine enjekte etmek için bir prosedür geliştirilmiştir doku embriyo. Zaman içinde canlı embriyolar bakteriyel enfeksiyon ilerleme izlemek için mikroskobik floresan bakteri Puanlama basit fakat güvenilir bir yöntem geliştirdi. Mikroskobik Puanlama sonuçları ile 20’den fazla koloni oluşturan birim (CFU) bakterilerin tüm embriyoların bakterilerin olumlu bir floresan sinyal verdiğini gösterdi. Biyomalzeme olası etkilerini enfeksiyon üzerinde çalışmaya, biz CFU numaralarını S. aureus ve 10 µm polistren mikroküreler (PS10) olmadan embriyo modeli Biyomalzeme olarak belirledi. Ayrıca, ObjectJ proje dosya “Zebra balığı-Immunotest ImageJ içinde faaliyet” S. aureus enfeksiyon ve PS10 olmadan zaman içinde floresans yoğunluğunu ölçmek için kullanılır. Her iki yöntem sonuçlarından S. aureus daha yüksek sayıda embriyo mikroküreler, biomaterial huzurunda bir artan enfeksiyon duyarlılık gösteren olmadan içinde mikroküreler ile enfekte embriyo gösterdi. Böylece, bu da çalışmanın potansiyel zebra balığı embriyo modelinin BAI burada geliştirilen Yöntemler ile çalışmaya gösterir.
Introduction
Tıbbi cihazlar (“Biyomalzeme” anılacaktır) çeşitli giderek modern tıpta dinlenme ya da insan vücudu parçaları1değiştirmek için kullanılır. Ancak, Biyomalzemeler implantasyonu enfeksiyona, implant ameliyatta önemli bir komplikasyonu olan bir biomaterial ilişkili enfeksiyon (BAI) adı verilen bir hasta açmaları. Staphylococcus aureus ve Staphylococcus epidermidis iki en yaygın bakteriyel türler BAI2,3,4için,5,6sorumlu vardır. Biyomalzeme formu bir yüzey bakteriyel biyofilm oluşumu için duyarlı implante. Ayrıca, yerel bağışıklık yanıtı bakteriyel temizleme azaltılmış etkinliğini neden implante Biyomalzeme tarafından dengesiz. Bakteri hastalık ilk izni esas olarak nötrofil, güçlü bir eklenen huzurunda bakterisidal kapasitesi azaltılmış veya biomaterial7implante infiltre tarafından gerçekleştirilir. Ayrıca, sonra nötrofil ilk akını kalan bakteri phagocytose ama etkili olamaz doku sızmak makrofajlar onları intracellularly, kombine varlığı bir sonucu olan sinyal dengesiz bağışıklık nedeniyle öldürmek biomaterial ve bakteri8. Böylece, Biyomalzemeler varlığı bakteri9,10,11,12,13 ve biyofilm oluşumu implante hücre içi yaşama kolaylaştırabilir Biyomalzeme4,14. Sonuç olarak, BAI başarısızlık yol ve implante Biyomalzeme, yenisiyle değiştirme için ek maliyeti2,15ile artan morbidite ve mortalite ve uzun süreli hastanede neden gerekir.
Anti-BAI stratejileri artan sayıda gelişmiş2,16,17davranıyorsun. İn vivo ilgili hayvan modellerinde bu stratejileri etkinliğinin değerlendirilmesi esastır. Ancak, geleneksel deneysel BAI hayvan modelleri (örneğin, fare modelleri) genellikle pahalı, zaman alıcı ve bu nedenle yüksek üretilen iş birden fazla stratejileri18test için uygun değildir. Son konak hücreleri ve bakteriler kollarındaki/floresan etiketlemeyi dayalı biyo-optik görüntüleme teknikleri geliştirilmesi tek küçük hayvanlarda BAI ilerleme ve ana bilgisayar-patojen/konak-malzeme etkileşimleri sürekli izlenmesi için izin verebilir Fareler18,19,20,21gibi. Ancak, bu teknik oldukça karmaşık ve henüz emekleme aşamasında, ve birkaç sorunu BAI18kantitatif analiz için ele alınması gerekir. Örneğin, bir yüksek meydan doz bakteriyel kolonizasyon görselleştirmek için gereklidir. Ayrıca, ışık saçılma ve Adsorpsiyon memeli test hayvanları da olmalıdır dokularda bioluminescence/floresan sinyallerin18,19,21ele. Bu nedenle, zaman içinde intravital görselleştirme ve kantitatif analiz için izin roman, uygun maliyetli hayvan modelleri BAI içinde vivo çalışmak için değerli tamamlayıcı sistemlerdir.
Zebra balığı (embriyo) ana bilgisayar-patojen etkileşim ve enfeksiyon Patogenez mikobakteriler22, Pseudomonas aeruginosa23, gibi çeşitli bakteri türlerinin dissekan için çok yönlü bir içinde vivo aracı olarak kullanılmıştır Escherichia coli24, Enterococcus faecalistir25ve stafilokoklar26,27. Zebra balığı embriyo optik şeffaflık, nispeten düşük bakım maliyeti ve memeliler28,29son derece benzer bir bağışıklık sistemi bulundurma gibi pek çok avantajı var. Bu son derece ekonomik, canlı model organizma intravital görselleştirme ve analiz enfeksiyon ilerleme ve ilişkili ana bilgisayar yanıt-e doğru28,29zebra balığı embriyo yapar. Görselleştirme hücre davranış içinde vivo, transgenik zebra balığı satırlarının bağışıklık hücreleri (, makrofajlar ve nötrofiller) farklı tipleri ile izin ve hatta fluorescently etiketli hücre altı yapıları ile geliştirilen28 ,29. Ayrıca, zebra balığı yüksek üreme oranı yüksek üretilen iş test sistemleri otomatik robot enjeksiyon, otomatik floresans miktar ve RNA dizisini analiz27, geliştirme imkanı sağlar 30.
Bu da çalışmanın, floresans görüntüleme teknikleri kullanarak biomaterial ilişkili enfeksiyon için bir zebra balığı embriyo model geliştirmek amaçlanmıştır. Bu amaçla, zebra balığı embriyo Kas dokusuna biomaterial mikroküreler huzurunda bakteri (S. aureus) enjekte etmek için bir yordam geliştirdi. Biz başka bir yerde başka bir S. aureus zorlanma10,31için açıklandığı gibi inşa edilmiştir S. aureus RN4220 ifade mCherry floresan protein (S. aureus– mCherry), kullanılır. Transgenik zebra balığı hattı (mpeg1: UAS/Kaede) Kaede makrofajlar32 ve mavi flüoresan polistren mikroküreler yeşil flüoresan protein kullanılan ifade. Bir önceki çalışmada, mikroküreler kas içi enjeksiyon biomaterial implantasyon taklit zebra balığı embriyo içine uygun33olduğunu göstermiştir. Kantitatif BAI ilerlemesini ve zaman içinde tek embriyo içinde ilişkili hücre infiltrasyonu, biz ki “ObjectJ” (bir eklenti ImageJ) içinde floresans yoğunluğunu ölçmek için ameliyat “Zebra balığı-Immunotest” proje dosyası olarak çözümlemeye ikamet eden bakteri ve mikroküreler33enjeksiyon yeri çevresinde infiltre makrofajlar. Buna ek olarak, biz koloni oluşturan numaralarını tespit Biyomalzeme olası etkilerini enfeksiyon üzerinde çalışmaya birimleri (CFU) varlığı ve yokluğu mikroküreler embriyo içinde bakteri. Bizim çalışmada burada geliştirilen Yöntemler ile zebra balığı embriyo biomaterial ilişkili enfeksiyonların içinde vivo çalışmak için umut verici, yeni bir omurgalı hayvan modeli olduğunu gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enfeksiyonu (BAI) biomaterial ilgili ciddi bir klinik komplikasyondur. Önlenmesi ve tedavisinde BAI geliştirmek için yeni anlayışlar BAI içinde vivo patogenezinde daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Ancak, geçerli BAI hayvan modeller fare modelleri gibi pahalı, emek yoğun ve karmaşık cerrahi tekniklerde uzmanlaşmış personel eğitim gerektirir. Bu nedenle, bu modeller yüksek üretilen iş analizi için uygun değildir. Zebra balığı embriyo bir roman omurgalı hayvan modeli olarak BAI içinde vivo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada mali Biyomedikal malzeme (BMM) programı IBIZA project tarafından desteklenen ve ortak Flamanca ekonomik işler Bakanlığı tarafından finanse. Yazarlar Prof. Dr. Graham Lieschke Monash Üniversitesi, Avustralya’dan zebra balığı mutant satır sağlamak için teşekkür etmek istiyorum (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).
Materials
| Tryptic soya agar | BD Difco | 236950 | Media preparation unit at AMC |
| Tryptic soya broth | BD Difco | 211825 | |
| Polyvinylpyrrolidone40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent) | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.) | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| Micropipette puller instrument | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| Light microscope LM 20 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Agarose MP | Roche | 11388991001 | |
| Stereo fluorescent microscope LM80 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Micromanipulator M3301 with M10 stand | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express micro-injector | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| Microtrube 2ml pp | Sarstedt | 72.693.005 | |
| Zirconia beads | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA lyser | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2) | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 medium |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Gyrotory shaker (for bacterial growth) | New Brunswick Scientific | G10 | |
| Zebrafish incubator | VWR | Incu-line | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Centrifuge | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| Spectrometer | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 well-plates | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 well-plates | Greiner bio-one | 655161 | |
| Petri-dish | Falcon | 353003 | |
| Petri-dish | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | Not applicable | Not applicable | link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | Not applicable |
Referências
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10 (2012).
- Otto, M. Staphylococcus epidermidis – the ‘accidental’ pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
- Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
- Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
- Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
- Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
- Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
- Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
- Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
- Darouiche, R. O. Current concepts – Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
- Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63 (2017).
- Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W., Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. , 307-354 (2013).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
- Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
- van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584 (2013).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
- Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697 (2009).
- Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
- Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
- Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
- Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
- Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
- Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
- Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -. V., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. , 7-37 (2002).
- Chaplin, W. T. P. . Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , (2017).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
- Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
- Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
- Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59 (2007).
- Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).
