Automatiserad bildbaserad kvantifiering av neutrofila extracellulära fällor med NETQUANT
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera neutrofila extracellulära fällor (NETs) och drift NETQUANT, en helautomatisk programvara alternativ för kvantifiering av nät i immunofluorescensbilder.
Abstract
Neutrofila extracellulära fällor (nät) är webb-liknande antimikrobiella strukturer som består av DNA och granule härledda antimikrobiella proteiner. Immunofluorescensmikroskopi och bildbaserade kvantifieringsmetoder är fortfarande viktiga verktyg för att kvantifiera neutrofila extracellulär fälla formation. Det finns dock viktiga begränsningar för de immunofluorescensbaserade metoder som för närvarande finns tillgängliga för kvantifiering av nät. Manuella metoder för bildbaserad NETTOKVANTIFIERING är ofta subjektiva, benägna att fel och tråkiga för användare, särskilt icke-erfarna användare. Även för närvarande finns tillgängliga programalternativ för kvantifiering antingen halvautomatiska eller kräver utbildning före operationen. Här demonstrerar Vi implementeringen av en automatiserad immunofluorescensbaserad bildkvantifieringsmetod för att utvärdera NETTOBILDNINGEN som kallas NETQUANT. Programvaran är enkel att använda och har ett användarvänligt grafiskt användargränssnitt (GUI). Den anser biologiskt relevanta parametrar såsom en ökning av ytan och DNA: netto markör protein förhållande, och nukleär deformation för att definiera netto bildning. Dessutom, detta verktyg är byggd som en fritt tillgänglig app, och möjliggör Single-cell upplösning kvantifiering och analys.
Introduction
Neutrofiler är avgörande medlare av medfödda värd försvar svar mot en mängd olika mikrobiella patogener1. De utför sina antimikrobiella funktioner genom att släppa sina granulat som innehåller ett brett spektrum av antimikrobiella proteiner2, producerar reaktiva syreradikaler (ros) och hypoklorit1, och genom fagocytos3. Dessutom har Brinkmann et al. 4 beskrivna neutrofila extracellulära fällor (Nets) som en ny mekanism genom vilken neutrofiler fälla och eliminera invaderande patogener. Sedan deras upptäckt lite över ett decennium sedan4, nät har varit inblandade i en mängd olika infektiösa5,6 och icke-infektiösa7 morbidities. NET formation är en aktiv process och resulterar i extrudering av kromatin DNA belagd med granule-härledda antimikrobiella proteiner8. Några av de viktigaste förändringarna i cellulära och nukleär morfologi i samband med netto bildning inkluderar förlust av nukleär morfologi, kromatin avkondensering, mobilisering av granule proteiner från cytoplasman till kärnan och en ökning av den nukleära och cellulära diameter8,9.
Den Web-liknande nät, som kan visas som diffusa strukturer något större än cellen eller som strukturer flera gånger större än en enda neutrofila betraktas som indikatorer på netosis5,10. Med hjälp av fluorescensmikroskopi kan nät detekteras genom att sondera DNA med en fluorescerande sond som 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och genom immunofluorescensfärgning mot NET-bundna proteiner som neutrofila elastase. Kvantifiering av överlappande Färgnings områden för DNA och NET-bundna proteiner bestämmer den totala ytan under NETs i en bild11.
Ett antal bildanalys alternativ finns tillgängliga för att utföra fluorescensbildbaserad kvantifiering av Nets11,12. Men dessa programalternativ presentera begränsningar i att inte vara användarvänliga och/eller helt automatiserad. I denna artikel, vi visar driften av NETQUANT13, en fritt tillgänglig app som kan utföra opartisk helt automatiserad immunofluorescensmikroskopi BILDBASERAD nettokvantifiering. Appen har ett användarvänligt grafiskt gränssnitt (GUI) och kan utföra Single-cell analys. Programvaran kvantifierar NETosis i en bild genom att upptäcka de morfologiska förändringarna i området av DNA-NET-bunden markör, kromatin dekondensation tillhörande deformation av kärnan och ökning av DNA: NET-bundet protein förhållande. Sammantaget tillåter de multipla netto definitionskriterierna en strikt nettokvantifiering över flera datamängder på ett förutsättningslös sätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Netto bildning är ett relativt Nytillskott till de olika neutrofila i4 och det har varit en märkbar våg av intresse att studera innebörden av nät i ett brett spektrum av forskningsområden5,7,14,15. Förvärv av bilder med hjälp av Immunofluorescensmikroskopi och efterföljande bildbaserad kvantifiering är en allmänt använd metod för att kvantifiera näten. Det…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet finansierades av Crafoordska stiftelsen (TM och PN), statens forskningsstipendium (PN, TM), Vetenskapsrådet (PN) och Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
Referências
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
