Vi presenterer her en utprøvd og testet protokoll for rensing av chloroplast protein import komplekser (TOC-TIC komplekse) bruke trykk-koden. Ett-trinns affinitet-isolasjon protokollen kan potensielt brukes til alle protein og brukes til å identifisere nye samhandling partnere av massespektrometri.
Chloroplast biogenesis krever import av kjernen-kodet proteiner i plastid. Import av disse proteinene er avhengig av translocon på ytre (Innholdsfortegnelsen) og indre (TIC) chloroplast membraner. Innholdsfortegnelse og TIC komplekser er multimeric og inneholder sannsynligvis ennå ukjent komponenter. Ett av hovedmålene i feltet er å etablere hele beholdningen av Innholdsfortegnelsen og TIC. For isolering av TOC-TIC komplekser og identifisering av nye komponenter endret preprotein reseptoren TOC159 har blitt N-Terminal med tillegg av tandem affinitet rensing (TAP) koden resulterer i trykk-TOC159. Trykk-koden er utformet for to sekvensiell affinitet rensing trinn (derav “tandem affinity”). Trykk-koden brukt i disse studiene består av et N-terminal IgG-bindende domene avledet fra Staphylococcus aureus Protein en (ProtA) etterfulgt av en calmodulin-binding peptid (CBP). Mellom disse to affinitet koder, en tobakk etse virus (TEV) protease cleavage nettstedet blitt inkludert. Derfor kan TEV protease brukes for mild elueringsrør av TOC159 inneholder komplekser etter binding til IgG perler. Protokollen presenteres her, ble det andre Calmodulin-affinity rensing trinnet utelatt. Rensing protokollen starter med forberedelse og solubilization av totale mobilnettet membraner. Etter vaskemiddel-behandling, er solubilized membran proteiner ruges med IgG perler for immunoisolation av trykk-TOC159-som inneholder komplekser. Bindende og omfattende vask, er trykk-TOC159 som inneholder komplekser kløyvde og løslatt fra IgG perler med den TEV protease der S. aureus IgG-bindende domenet er fjernet. Vestlige blotting av den isolerte TOC159 inneholder komplekser kan brukes til å bekrefte tilstedeværelse av kjent eller mistenkt Innholdsfortegnelsen og TIC proteiner. Enda viktigere, har TOC159 inneholder komplekser blitt brukt med hell å identifisere nye komponenter av innholdsfortegnelse og TIC komplekser av massespektrometri. Protokollen som presenterer vi potensielt kan effektiv isolasjon av noen membran-bundet protein kompleks som skal brukes til å identifisere ennå ukjent komponenter av massespektrometri.
Planter avhengig chloroplasts for fotosyntesen og photoautotrophic vekst1. De aller fleste chloroplast proteiner er kodet i kjernen, syntetisert i stoffer og importeres til chloroplast via TIC og innholdsfortegnelse komplekser i konvolutten membraner2. Kjernen i Innholdsfortegnelsen kompleks består av to reseptoren GTPases Toc33 og Toc1593,4,5Toc75 protein-drive kanalen. TOC159 er viktig for biogenesis av chloroplasts og formidler massiv akkumulering av fotosyntesen-assosiert proteiner6. TIC komplekset består av TIC20 protein-drive kanalen, samt TIC110 og TIC407,8. Nylig en 1MD protein translokasjon complex på indre konvolutt membranen ble isolert og inneholdt tidligere uidentifiserte komponenter9, en av dem var TIC56. Vi har nylig co isolert TIC56 av det 1 MDa komplekse ved hjelp av trykk-TOC159 affinitet rensing protokollen. Dataene viser en strukturell overlapping mellom “kanoniske” Innholdsfortegnelsen/TIC komplekser og 1 MDa komplekse10. Tidligere ble ukjent komponenter som KOC1 også identifisert som nye samhandling partnere i Innholdsfortegnelsen og TIC komplekser med trykk-metoden beskrevet her10,11.
Dermed er trykk-tag rensing en effektiv metode for isolering av protein komplekser og identifikasjon av samspill partnere med påfølgende masse spectrometric analyse12. Trykk koden består av to IgG bindende gjentar atskilt fra en calmodulin-binding peptid (CBP) med en tobakk etse virus (TEV) protease cleavage området. Den opprinnelige metoden, bestående av et IgG-affinitet rensing skritt etterfulgt av TEV cleavage og påfølgende calmodulin affinitet kromatografi tillatt innfødt rensing av store og svært ren protein komplekser13,14 . Vi har forenklet prosedyren og vist at TOC159 inneholder protein komplekser kan også bli renset effektivt bruker bare IgG-affinitet rensing skritt etterfulgt av TEV-cleavage elueringsrør15. I vår erfaring, unnlatelse av calmodulin-affinitet trinnet resultert i høyere avkastning og kan derfor være hensiktsmessig for lav overflod proteiner.
Kort sagt, vi utviklet stabil transgene A. thaliana uttrykke trykk-TOC159 i ppi2 (toc159 KO mutant) bakgrunn og etablerte det som en pålitelig kilde for rensing av TOC-TIC komplekser. Protokollen for isolering av TOC-TIC komplekset starter med homogenisering av plantemateriale i en vaskemiddel uten buffer. Etter sentrifugering forkastes nedbryting. Pellet inneholder totalt membran brøkdel er solubilized med en detergent inneholder buffer. Etter en ultra-sentrifugering trinn brukes nedbryting som inneholder solubilized TOC-TIC komplekser IgG-harpiks for affinitet rensing. Etter flere vask trinn, elueringsrør utføres ved hjelp av en TEV protease inneholder buffer selektivt deler nedstrøms IgG-bindende domenene og forsiktig løslate innfødt TOC159 inneholder komplekser. Den TEV eluate kan analyseres direkte ved Western blotting eller massespektrometri å identifisere samhandling partnerne TOC15910,11,15. Metoden har også blitt brukt til å identifisere post-translasjonell modifikasjoner av TOC15915. I fremtiden, kan innfødt TOC159 inneholder komplekser brukes til strukturell studier med cryoelectron mikroskopi.
Vi vist at et enkelttrinn trykk tag rensing er en bestemt og effektiv metode for rensing av Arabidopsis TOC-TIC komplekset. Selv om trykk-koden vil tillate to påfølgende rensing trinn (IgG-etterfulgt av calmodulin affinitet rensing etter TEV protease-cleavage), tror vi at i mange tilfeller affinitet steg etterfulgt av TEV protease cleavage vil være tilstrekkelig. Vårt mål, TOC159, er lav rikelig og inkludering av andre calmodulin-affinitet trinn overdrevet redusert protein avkastningen som var Hovedårsaken til utelate det fra vår nåværende protokollen. TEV-tilsettes i seg selv er svært bestemt og milde rensing som slipper bare trykk-merket målet sammen med tilknyttede samhandling partnere mens forurensende proteiner stikker nonspecifically til IgG harpiks vil fortsatt være der. Således, i kombinasjon med IgG-affinitet trinn, TEV tilsettes resulterer i en tilstrekkelig effektiv rensing for våre og sannsynligvis mange andre formål.
Må utvises at Konstruer trykk-merket er fullt funksjonell i vivo. Trykk merking kan ha potensielt skadelige effekter på protein aktivitet, stabilitet eller lokalisering. TOC159 består av tre domener, N-terminal surt domenet, sentrale GTP-bindende domene og C-terminalen membran domene, som forankrer TOC159 i ytre chloroplast membran2. For å unngå forstyrrelser med membran innsetting, smeltet vi trykk-koden til N-terminus av TOC159. Fusion å N-terminus er heller unntaket enn regelen. Mange proteiner inneholder N-terminal målinformasjon og bør derfor ved merket på C-terminus. Vi forsikret at TOC159 er funksjonelle i vivo ved complementation av ppi2 mutant (en albino mutant mangler TOC159) med trykk-TOC159. Redning av grønne, vill type fenotypen indikerte trykk-TOC159 funksjonell15.
Rensing protokollen ble brukt til å identifisere nye samhandling partnere av TOC159, som inkludert KOC1 og TIC5610,11. Totalt var 30 proteiner assosiert med komplekse antyder at ny samhandling partnere vil bli isolert og preget i nær fremtid. Mens vi anbefaler trykk-koden for komplekse rensing, ønsker vi fortsatt å påpeke at flere versjoner til den presenteres her finnes og kan være svært nyttig for enkelte programmer.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av tilskudd fra Swiss National Science Foundation (31003A_156998 og 31003A_176191) og University of Neuchatel.
NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
EDTA | Carl Roth | 8043 | |
Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
Filter paper | Whatman | 10311804 | |
Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |