利用隔离的完美大鼠小肠进行肠道激素分泌的机制
Summary
在这里, 我们提出了一个强大的生理模型, 研究肠道激素分泌和肠道吸收的分子机制-孤立的灌注大鼠小肠。
Abstract
肠道是人体最大的内分泌器官, 产生超过15种不同的肽激素, 调节食欲和食物的摄入、消化、营养的吸收和分配, 以及餐后葡萄糖出游。了解调节肠道激素分泌的分子机制是理解和转化肠道激素生理的基础。传统上, 肠道激素分泌的机制要么在体内研究 (在实验动物或人类), 要么使用肠道激素分泌的初级黏膜细胞培养或细胞系。在这里, 我们介绍了一个孤立的灌注大鼠小肠作为研究肠道激素分泌的替代方法。该模型的优点是, 它依赖于完整的肠道, 这意味着它重述了大多数生理上重要的参数, 负责分泌在体内的研究, 包括粘膜极化, 副父母关系和途径刺激暴露。此外, 与体内研究不同的是, 孤立的灌注大鼠小肠可以进行几乎完整的实验控制和直接评估分泌物。与体外研究不同的是, 有可能研究分泌物的大小和动态, 并解决重要的问题, 比如什么刺激会导致不同肠道激素的分泌, 肠道的哪一侧 (腔或血管) 是分泌物刺激, 并详细分析分泌反应背后的分子传感器。此外, 该制剂是研究肠道吸收的有力模型, 也是包括负责运输者在内的肠道吸收动力学细节的有力模型。
Introduction
肠道是人体最大的内分泌器官, 产生超过15种不同的肽激素, 调节营养吸收和营养倾向, 肠道生长和调节食欲1。因此, 肠道激素参与了许多基本的生理过程, 了解这些分泌模式和控制各自激素分泌的分子细节对我们的基本生理很重要了解和解决肠道激素作用的翻译方面;但如何研究肠道激素分泌的分子传感机制呢？一般来说, 激素分泌可以研究完整的生物体 (人或实验动物), 从孤立的肠道制剂或肠道激素分泌的原代细胞培养物或永生细胞培养 2,3,4 个,5,6. 我们喜欢的模型是孤立的灌注大鼠小肠, 这是一个生理上相关的模型, 可以用最佳的时间分辨率详细研究肠道激素的分泌 (分泌率可以随时确定从下面到第二个), 结果很可能是可转移到体内的情况7。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 如何执行这个程序, 但首先, 我们将讨论研究肠道激素分泌的其他方法, 包括这些模型相比, 孤立的灌注大鼠小肠的好处和局限性。
如果你想确定一个特定的化合物是否调节某些肠道激素的分泌, 在人类的研究是最终目标。因此, 如果一种化合物对啮齿类动物 (体内或灌注) 或激素分泌细胞 (细胞系或原生细胞) 中的一种或几种肠道激素的分泌有很大影响, 这种作用只有在能够得到证实的情况下, 才与医学和人体生理有关在人类。然而, 可以在人类身上进行的研究类型有明确的限制, 因此, 对实验动物的体内研究往往是此类研究的第二好选择。老鼠和老鼠是最常用的实验动物, 大概是因为它们体积小、成本低, 而且可以选择从基因上改变被怀疑参与特定研究问题的基因 (例如, 击倒某个传送器或受体)。一般来说, 体内模型受益于生理上的完整, 但也有几个局限性。最重要的是, 啮齿类动物, 特别是老鼠的小尺寸是一个限制因素, 因为大多数肠道激素定量检测需要至少20μl 的血浆 (而且往往更多), 这意味着至少需要提取100μl 的血液才能复制量化。因此, 只能获得与基线样本和一个或两个刺激后样本相对应的极少数样本 (小鼠的总血量为 ~ 1.4 ml)。因此, 可能会漏掉潜在的分泌反应 (例如, 快速或后期发生的反应)。
在灌注模型中, 这个问题被克服了, 因为获得了大量的样品量 (流量: 7.5 mL/min), 并且可以根据需要调整收集间隔, 以确保快速和短期的反应不会被错过 (我们每分钟收集样本)7.啮齿类动物体内研究的另一个问题是, 大多数肠道激素的消除或代谢速度甚至比人类8、9、10 更快, 这可能会使随后的生化分析复杂化。例如, 我们表明, glp-1 在小鼠体内的代谢速度甚至比人类快 (其中 t—–一半是 1-2分钟11), 更重要的是, 在小鼠体内的 glp-1 裂解除了 n 端裂解外, 还包括 n 端裂解。二肽肽酶-4 (dpp4) (是人类主要的 glp-1 降解酶), 进一步裂解酶中性内皮肽酶 24.11 12.因此, 目前对 glp-1 定量的商业检测, 要么是基于 glp-1 (7-36amide 胺) 的完整异形, 要么是基于 dpp-4 切割异形 (9-39 酰胺), 大大低估了小鼠的 glp-1 分泌, 导致了误导的结果12. 在孤立的灌注大鼠小肠中, 分泌激素的大部分代谢被消除或明显减少, 因为可以避免血浆介导的降解, 并防止肝肾肺/肺分泌降解 (因为香水是收集, 因为它离开肠道)。
当然, 使用转基因动物可以产生重要的洞察力, 例如钠葡萄糖转运体- 1 淘汰赛小鼠 13, 但对参与分泌的分子传感器进行详细评估往往需要考虑多个分子位点, 从分子转运到离子通道, 从不同的 g-蛋白质偶联受体到细胞内蛋白质。例如, 当我们分解负责葡萄糖刺激 glp-1 分泌的分子传感器 7时, 我们针对九个不同分子位点的活动.在体内不可能进行类似的调查, 因为所使用的一些化合物具有不具体或有害的致命影响。例如, 当使用灌注肠道时, 可以通过用 2-4-dinitro酚7, 14 阻断 atp 形成来评估细胞内葡萄糖代谢对 glp-1 和神经紧张素分泌的作用, 以及压门控钙通道对胆汁酸刺激 glp-1、nt 和 pyy 分泌物 3。事实上, 剧毒钠通道阻滞剂河豚毒素可以成功地应用于灌注研究。最后, 在灌注模型中, 可以直接评估在肠道中某种化合物刺激某种激素分泌的地方, 因为研究者可以简单地选择和准备所需的区域进行灌注, 同时也可以对其进行调查刺激是否通过激活来自肠道腔侧或血管侧的分子传感器引起分泌 3,15,16。
肠道激素分泌的分泌机制也可以通过肠道组织块 (包括人体组织)、初级肠道培养 (通常来自小鼠)、永生激素分泌细胞系 (老鼠或人类来源)、肠道来研究安装在使用室或由有机体 (最常见的是从小鼠)2,3,4,5, 6,17,18的组织。与肠道灌注相比, 对人体肠道溃疡的研究、原代细胞培养物和细胞系在技术上更容易进行, 是一种更快、更便宜的数据生成方式, 但当然, 对肠道碎片的研究需要获得新鲜的人体肠道标本。然而, 在这些模型中, 肠道的正常细胞极化本质上是丢失的, 这意味着这些模型不能用来评估分子传感器的正常激活, 吸收过程也不能研究。此外, 这类研究通常采用静态孵育 (长达几个 h), 这是高度非生理的, 与细胞的正常分泌动力学无关, 因为分泌的产品没有被去除, 因此可能会反馈影响激素的分泌。相反, 在灌注的肠道中, 分泌和吸收的分子在体内被黏膜微循环有效去除, 从而确保黏膜上的梯度得到维持, 从而以正常的速度进行吸收和分泌。此外, 细胞培养物可能与其本地肠内分泌细胞起源的分化, 这意味着它们在肽含量和分子传感器表达方面不再代表原生细胞, 尽管它们可能仍然存在分泌有问题的激素。例如, glp-1 分泌细胞系19的情况就是如此.
因此, 我们认为, 初级细胞培养物或细胞系研究最适合于筛查目的, 也最适合进行体内或孤立的灌注肠道内无法进行的类型实验。例如, 原代细胞培养物和细胞系培养物的真正强度是, 可以实时监测细胞内的二级信使 (如 ca2 +、camp、nad (p) h), 并可实时监测激素分泌细胞的电信号。调查了 20,21,22。此外, sirna 击倒可以做, 这是特别有用的, 如果没有特定的抑制剂没有20,21,22,23,24。最近, 安装在 ussing 室内的小鼠的肠道组织被用来研究胆汁酸刺激 glp-1 分泌的分子机制, 而肠道有机体 (来自小鼠) 和人类肠道碎片也被用来研究肠道激素分泌的分子细节17,25。而前者的好处是从两极分化2所有这些模型涉及静态孵化。然而, 对人类肠道碎片的研究受益于使用人类而不是啮齿类动物组织, 这一点很重要, 因为7tm 受体和分子转运体在组织表达方面的物种差异可能会导致它们之间的分子传感路径不同物种。事实上, 这一领域的大多数数据都是通过对猪、老鼠或老鼠的研究产生的, 这些发现能否转移到人类身上仍然是难以捉摸的。然而, 令人放心的是, 葡萄糖刺激的 glp-1 分泌的分子传感机制在小鼠、大鼠、人、细胞的转录和肽分析中似乎相似, 显示出强大的全球强这两个物种之间的相似性7,18,26,27。
然而, 孤立的灌注大鼠小肠也有一些局限性, 应该加以考虑。最重要的是, 不可能确定特定分泌反应是由目标激素产生细胞的测试物质直接激活产生的结果, 还是由间接机制引起的。例如, kcl 立即增加 glp-1 分泌从灌注肠 7, 但它仍然是未知的是 l 细胞的直接去极化的结果, 或由靠近 l 细胞的神经元去极化或影响同时释放副分泌物刺激物抑制剂。因此, 利用灌注肠道进行的研究所产生的数据, 其目的是阐明分泌物背后的分子机制, 应始终结合从其他更具体的模型获得的数据, 以提高建立因果 关系。例如, 葡萄糖刺激的 glp-1 分泌细胞系 glutag28、29和原代小鼠 l 细胞的葡萄糖刺激 glp-1 分泌依赖于葡萄糖转运体 (sglt1 和 glut2) 的活性。将这些转运体阻断在灌注大鼠小肠中也会减弱分泌物20, 这意味着葡萄糖刺激的 glp-1 分泌物很可能主要是由葡萄糖对 l 细胞的直接作用介导的。孤立的灌注肠的另一个重要限制是, 由于脂质的疏水性, 一些脂质难以研究。虽然有可能研究脂质消化的最终产物 (脂肪酸、二乙酰甘油、溶血磷脂酰甘油等), 虽然制剂可能能够重新酯化细胞内的脂质, 也许可以将其包装成细胞内的脂质乳胶, 从细胞中运输的子, 以及它们随后被绒毛的乳汁吸收, 都被破坏了, 因为孤立的肠道中的淋巴流动无法得到保障。因此, 一旦被吸收的产物开始在细胞中积累, 脂质吸收很可能会停止。体外细胞系统由于缺乏极化而更不适合进行脂质研究。显然, 这种限制只适用于通过乳牙吸收和运输的脂类, 而通过肠道血管吸收的脂质很可能得到正常处理。
Protocol
Representative Results
Discussion
孤立的灌注大鼠小肠是一个强大的研究工具, 使动态和分子机制下的肠道激素分泌的细节研究。使用此模型成功生成数据的最关键步骤是手术。肠道的处理将不可避免地对肠道造成一些损害, 因此应保持在绝对的最低限度。更重要的是, 手术速度是关键, 特别是在肠系膜动脉中放置导管的时间方面。我们的经验是, 导尿管应该成功放置, 在切断血管上的洞之后, 应该在几分钟内启动灌注。导管的放置?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了诺和诺德基本代谢研究中心 (丹麦诺沃诺德基金会) 的 jens juul holst 教授不受限制的资助, 这是诺和诺德基金会为进行鼠患灌注研究而提供的一笔单独赠款 (赠款编号)。nnf15oc0016574), 欧洲研究理事会 (第66969号赠款) 和欧洲联盟第七个研究、技术发展和示范活动框架方案 (266408 赠款) 的霍尔斯特教授赠款以及博士后伦德贝克基金会向 rune e. kuhre 提供的赠款 (R264-2017-3492)。我们感谢詹娜·亨特和卡洛琳·迪肯仔细校对。
Materials
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
Referências
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