अलग perfused चूहे छोटी आंत का उपयोग आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित तंत्र
Summary
यहां, हम एक शक्तिशाली और शारीरिक के लिए आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित आणविक तंत्र और आंतों के अवशोषण का अध्ययन मॉडल वर्तमान-पृथक perfused चूहे छोटी आंत ।
Abstract
आंत शरीर का सबसे बड़ा अंतःस्रावी अंग है, जो 15 से अधिक विभिन्न पेप्टाइड हार्मोन का उत्पादन करता है जो भूख और भोजन का सेवन, पाचन, पोषक तत्व अवशोषण और वितरण को विनियमित करते हैं, और पोस्ट-पर्डियल ग्लूकोज भ्रमण करते हैं । आणविक तंत्र को समझना जो आंत हार्मोन स्राव को विनियमित करता है, आंत हार्मोन फिजियोलॉजी को समझने और अनुवाद करने के लिए मौलिक है । परंपरागत रूप से, आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित तंत्र या तो vivo में अध्ययन कर रहे हैं (प्रयोगात्मक जानवरों या मनुष्यों में) या आंत हार्मोन स्रावित प्राथमिक श्लेष्मल सेल संस्कृतियों या सेल लाइनों का उपयोग. यहां, हम आंत हार्मोन स्राव का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में एक अलग perfused चूहे छोटी आंत परिचय । इस मॉडल के गुण हैं कि यह बरकरार पेट पर निर्भर करता है, जिसका अर्थ है कि यह विवो अध्ययन में स्राव के लिए जिम्मेदार भौतिक रूप से महत्वपूर्ण मापदंडों के सबसे recapitulates, म्यूकोसल ध्रुवीकरण सहित, paracrine रिश्तों और मार्गों छिड़काव/ इसके अलावा, और विवो अध्ययन में विपरीत, पृथक perfused चूहे छोटी आंत लगभग पूरा प्रयोगात्मक नियंत्रण और स्राव के प्रत्यक्ष आकलन के लिए अनुमति देता है । इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, यह दोनों परिमाण और स्राव की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए और महत्वपूर्ण सवालों का पता करने के लिए संभव है, जैसे कि क्या उत्तेजकता अलग आंत हार्मोन के स्राव का कारण, आंत के किस तरफ से (luminal या संवहनी) स्राव है उत्तेजित, और विस्तार आणविक सेंसर स्रावी प्रतिक्रिया अंतर्निहित में विश्लेषण करने के लिए. इसके अलावा, तैयारी आंतों के अवशोषण और जिम्मेदार ट्रांसपोर्टरों सहित आंतों के अवशोषण की गतिशीलता के बारे में जानकारी के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है ।
Introduction
आंत शरीर के सबसे बड़े अंतःस्रावी अंग है, 15 से अधिक विभिन्न पेप्टाइड हार्मोन है कि पोषक तत्व अवशोषण और पोषक तत्व स्वभाव, आंतों के विकास को विनियमित और भूख मिलाना1उत्पादन. आंत हार्मोन, इसलिए कर रहे हैं, कई मौलिक शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल, और स्राव के इन नमूनों को समझने और संबंधित हार्मोन के स्राव नियंत्रण कि आणविक विवरण हमारे बुनियादी शारीरिक के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है समझ और आंत हार्मोन क्रियाओं के स्थानांतरीय पहलुओं को संबोधित करने के लिए; लेकिन कैसे एक आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित आणविक संवेदन तंत्र का अध्ययन कर सकते हैं? सामान्य में, हार्मोन स्राव बरकरार जीवों में अध्ययन किया जा सकता है (मनुष्यों या प्रयोगात्मक जानवरों), पृथक आंत की तैयारी से या आंत हार्मोन से स्रावित प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों या अमर सेल संस्कृतियों2,3, 4 , 5 , 6. हमारा पसंदीदा मॉडल अलग perfused चूहे छोटी आंत है, जो एक भौतिक रूप से प्रासंगिक मॉडल है कि आंत हार्मोन के स्राव को इष्टतम समय संकल्प के साथ विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है (स्राव दरें किसी भी समय के साथ निर्धारित किया जा सकता है दूसरा करने के लिए नीचे बेस), और परिणाम की संभावना एक vivo स्थिति7में transferrable हैं । यहाँ, हम कैसे इस प्रक्रिया को करने के लिए पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, लेकिन पहले हम आंत हार्मोन स्राव का अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों पर चर्चा करेंगे, लाभ और इन मॉडलों की सीमाओं अलग perfused चूहे छोटी आंत की तुलना में सहित.
यदि एक स्थापित करना चाहता है कि एक विशिष्ट यौगिक कुछ आंत हार्मोन के स्राव को नियंत्रित करता है, मनुष्यों में अध्ययन अंतिम लक्ष्य हैं. इस प्रकार, यदि एक यौगिक कृंतकों में एक या कई आंत हार्मोन के स्राव पर महान प्रभाव से पता चलता है (vivo या perfusions में) या हार्मोन स्रावित कोशिकाओं से (सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं), यह प्रभाव केवल चिकित्सा और मानव शरीर क्रिया विज्ञान के लिए प्रासंगिक है अगर यह पुष्टि की जा सकती है मनुष्यों में । हालांकि, मनुष्यों में प्रदर्शन किए जा सकने वाले अध्ययनों के प्रकार के लिए स्पष्ट सीमाएं हैं, और प्रायोगिक जानवरों पर vivo अध्ययन में, इसलिए, अक्सर ऐसे अध्ययनों के लिए दूसरा सबसे अच्छा विकल्प होता है । चूहों और चूहों सबसे अक्सर इस्तेमाल प्रयोगात्मक उनके सुविधाजनक आकार, कम लागत और आनुवंशिक रूप से विशिष्ट अध्ययन के सवालों में शामिल होने का संदेह जीन में परिवर्तन करने के लिए विकल्प के कारण पशुओं रहे हैं (उदाहरण के लिए, एक निश्चित ट्रांसपोर्टर से बाहर दस्तक या रिसेप्टर) । सामांय में, vivo मॉडल में भौतिक रूप से बरकरार होने से लाभ, लेकिन यह भी कई सीमाएं हैं । सबसे महत्वपूर्ण बात, कृंतकों के छोटे आकार, विशेष रूप से चूहों, एक सीमित कारक है, के रूप में आंत हार्मोन परिमाणन के लिए सबसे assays प्लाज्मा (और अक्सर बहुत अधिक) के कम से 20 μl की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि कम से १०० μl रक्त का एक डुप्लिकेट बनाने के लिए वापस ले लिया जाना है परिमाणन. इसलिए, यह केवल आधारभूत नमूनों और एक या दो के बाद उत्तेजना नमूने के लिए इसी बहुत कुछ नमूने प्राप्त करने के लिए संभव है (20 ग्राम के एक चूहे में कुल रक्त की मात्रा ~ १.४ मिलीलीटर है). नतीजतन, संभावित स्रावी प्रतिक्रियाओं (जैसे, तेजी से या देर से आने वाली प्रतिक्रियाओं) इसलिए याद किया जा सकता है.
परफ्यूजन मॉडल में, इस समस्या को दूर है, के रूप में बड़े नमूना मात्रा प्राप्त कर रहे हैं (प्रवाह दर: ७.५ मिलीलीटर/मिनट) और संग्रह अंतराल के रूप में सुनिश्चित करें कि तेजी से और कम स्थायी प्रतिक्रियाओं याद नहीं कर रहे हैं करने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित किया जा सकता (हम नमूने हर मिनट इकट्ठा)7 . कुतर में vivo अध्ययन में एक और मुद्दा यह है कि सबसे आंत हार्मोन भी अधिक तेजी से सफाया कर रहे है या मनुष्यों की तुलना में metabolized8,9,10, जो बाद में जैव रासायनिक विश्लेषण जटिल हो सकता है । उदाहरण के लिए, हमने दिखाया है कि जीएलपी-1 चूहों में मनुष्यों की तुलना में एक भी तेजी से दर पर metabolized है (जहां टी1/2 1-2 ंयूनतम11है) और, और अधिक महत्वपूर्ण बात, कि glp-चूहों में 1 की दरार शामिल है, N-टर्मिनल दरार के अलावा द्वारा dipeptidyl-पेप्टाइडेस-4 (DPP4) (जो मनुष्यों में प्रमुख जीएलपी-1 अपमानजनक एंजाइम है), एंजाइम तटस्थ endopeptidase २४.११12द्वारा आगे दरार । फलस्वरूप, glp-1 के परिमाणन के लिए वर्तमान वाणिज्यिक assays, जो या तो जीएलपी-1 (7-36amide) या डीपीपी-4 cleaved समरूप (9-39amide) के अक्षुण्ण समरूप पर आधारित हैं, काफी चूहों में जीएलपी-1 स्राव को कम आँकना और भ्रामक परिणामों में परिणाम 12. पृथक perfused चूहे छोटी आंत में, स्रावित हार्मोन के चयापचय के अधिकांश समाप्त हो जाता है या स्पष्ट रूप से कम है, के बाद से प्लाज्मा-मध्यस्थता क्षरण से बचा जाता है, और जिगर/ इसे आंत के पत्तों के रूप में एकत्र किया जाता है) ।
बेशक, महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं के उपयोग द्वारा उत्पंन किया जा सकता है, जैसे, सोडियम ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर-1 पीटकर चूहों13, लेकिन आणविक स्राव में शामिल सेंसर का एक विस्तृत मूल्यांकन अक्सर की आवश्यकता है कई आणविक साइटों के विचार, आणविक ट्रांसपोर्टरों से आयन चैनलों और अलग जी से लेकर-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स इंट्राकोशिलर प्रोटीन के लिए. उदाहरण के लिए, हमने नौ अलग आणविक साइटों की गतिविधि को लक्षित किया जब ग्लूकोज-उत्तेजित जीएलपी-1 स्राव7के लिए जिम्मेदार आणविक सेंसर को unraveling किया । वीवो में इसी तरह की जांच संभव नहीं होगी क्योंकि कुछ यौगिकों का उपयोग अविशिष्ट या हानिकारक/घातक प्रभाव है । उदाहरण के लिए, जब perfused आंत का उपयोग कर, यह 2-4-dinitrophenol7,14 के साथ ही की भूमिका के साथ एटीपी गठन अवरुद्ध द्वारा glp-1 और न्यूरोटेनसिन के स्राव के लिए अंतर-सेलुलर ग्लूकोज चयापचय की भूमिका का आकलन करने के लिए संभव था पित्त अम्ल के लिए वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल उत्तेजित जीएलपी-1, एनटी और pyy स्राव3. दरअसल, अत्यधिक विषाक्त सोडियम चैनल अवरोधक टेट्रोडोटॉक्सिन सफलतापूर्वक छिड़काव अध्ययन में लागू किया जा सकता है । अंत में, छिड़काव मॉडल में यह सीधे मूल्यांकन किया जा सकता है जहां आंत में एक निश्चित यौगिक एक निश्चित हार्मोन के स्राव को उत्तेजित करता है, के रूप में अन्वेषक बस का चयन और perfuse करने के लिए वांछित क्षेत्र तैयार कर सकते हैं, और एक ही समय में यह जांच की जा सकती है क्या एक उत्तेजना आंत के luminal या संवहनी पक्ष से आणविक सेंसर के सक्रियण द्वारा स्राव का कारण बनता है3,15,16.
आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित स्रावी तंत्र भी आंत ऊतक टुकड़े का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है (मानव ऊतक सहित), प्राथमिक आंतों संस्कृतियों (चूहों से आम तौर पर), अमर हार्मोन स्रावित कोशिका लाइनों (माउस या मानव मूल के), आंत द्वारा ऊतक ussing कक्षों में या organoids द्वारा घुड़सवार (दोनों सबसे चूहों से अक्सर)2,3,4,5,6,17,18। आंतों की तुलना में, मानव आंत के टुकड़ों पर अध्ययन, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों और सेल लाइनों के लिए तकनीकी रूप से आसान प्रदर्शन कर रहे है और डेटा पैदा करने का एक तेज और सस्ता तरीका है, लेकिन पाठ्यक्रम आंत टुकड़े के अध्ययन के लिए ताजा मानव आंत के लिए उपयोग की आवश्यकता है नमूनों. हालांकि, इन मॉडलों में आंत के सामान्य कोशिका ध्रुवीकरण स्वाभाविक खो दिया है, जिसका अर्थ है कि इन मॉडलों आणविक सेंसर के सामान्य सक्रियण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता, और अवशोषण प्रक्रियाओं भी अध्ययन नहीं किया जा सकता. इसके अलावा, इस तरह के अध्ययनों में आमतौर पर स्थिर इनक्यूबेशंस को रोजगार (कई एच के लिए) जो अत्यधिक गैर-शारीरिक है और कोशिकाओं की सामान्य स्रावी गतिशीलता के साथ कुछ नहीं करना पड़ता है, क्योंकि स्रावित उत्पाद को हटाया नहीं जाता है और इस प्रकार प्रतिक्रिया हो सकती है हार्मोन का स्राव. इसके विपरीत, सुगंधित आंत में, स्रावित और अवशोषित अणुओं को कुशलतापूर्वक म्यूकोसल माइक्रोपरिसंचरण द्वारा हटा दिया जाता है क्योंकि वे विवो में हैं, यह सुनिश्चित करना कि ट्रांसम्यूकोसल ग्रेडिएंट्स का रखरखाव किया जाता है, इसलिए अवशोषण और स्राव सामान्य दर से हो सकता है । इसके अलावा, कोशिका संस्कृतियों उनके देशी enteroendocrine कोशिका मूल से विभेदित हो सकता है, जिसका अर्थ है कि वे अब पेप्टाइड सामग्री और आणविक सेंसर की अभिव्यक्ति के मामले में देशी कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं, हालांकि वे अभी भी कर सकते हैं सवाल में हार्मोन छिपाना. यह है, उदाहरण के लिए, glp के लिए मामला-1 सेल लाइनों19स्राटिंग ।
यह है, इसलिए, हमारी राय है कि प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों या सेल लाइन के अध्ययन के प्रयोजनों के स्क्रीनिंग के लिए सबसे उपयुक्त है और प्रकार के प्रयोगों है कि vivo में या अलग perfused आंत में नहीं किया जा सकता प्रदर्शन के लिए । उदाहरण के लिए, प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों और सेल लाइन संस्कृतियों की एक असली ताकत है कि अंतर सेलुलर माध्यमिक संदेशवाहक (जैसे Ca2 +, शिविर, NAD (पी) एच) वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है, और हार्मोन स्राविटिंग कोशिकाओं के विद्युत संकेतन किया जा सकता है 20,21,22की जांच की । इसके अलावा, सिरना पछाड़ा किया जा सकता है, जो विशेष रूप से उपयोगी है अगर विशिष्ट अवरोही उपलब्ध नहीं हैं20,21,22,23,24. चूहों से आंत ऊतक ussing कक्षों में घुड़सवार हाल ही में पित्त-एसिड उत्तेजित glp-1 स्राव अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि आंतों organoids (चूहों से) और मानव आंत टुकड़े भी अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है आंत हार्मोन के स्राव के आणविक विवरण17,25. जबकि इन मॉडलों के2 polarized जा रहा से पूर्व लाभ स्थैतिक इनसेबेशंस शामिल है । मानव आंत के टुकड़ों पर अध्ययन, तथापि, मानव का उपयोग करने के बजाय, rodent से लाभ, ऊतक जो 7tm रिसेप्टर्स और आणविक ट्रांसपोर्टरों की ऊतक अभिव्यक्ति में प्रजातियों के अंतर के बाद से महत्वपूर्ण है अलग आणविक संवेदन रास्ते में परिणाम हो सकता है प्रजातियां. वास्तव में, इस क्षेत्र में सबसे अधिक डेटा या तो सूअर, चूहों या चूहों पर अध्ययन द्वारा उत्पंन किया गया है, और यह मायावी रहता है कि क्या इन निष्कर्षों मनुष्यों को हस्तांतरित किया जा सकता है । यह है, तथापि, आश्वस्त है कि आणविक संवेदन तंत्र है कि आबाद ग्लूकोज-उत्तेजित glp-1 स्राव माउस, चूहा, आदमी, और transcriptomic और माउस और मानव एल कोशिकाओं के बीच समान होना प्रकट मजबूत वैश्विक पता चला दोनों प्रजातियों के बीच समानता7,18,26,27.
पृथक perfused चूहे छोटी आंत, तथापि, यह भी कुछ सीमाएं है कि विचार किया जाना चाहिए है । सबसे महत्वपूर्ण बात, यह निर्धारित करना असंभव है कि प्रत्यक्ष सक्रियण से एक दिया स्रावी प्रतिक्रिया परिणाम लक्षित हार्मोन उत्पादक कोशिकाओं के परीक्षण पदार्थ द्वारा या बल्कि एक अप्रत्यक्ष तंत्र के कारण होता है. उदाहरण के लिए, kcl तुरंत perfused आंत7से glp-1 स्राव बढ़ जाती है, लेकिन यह अज्ञात है कि क्या यह एल सेल के प्रत्यक्ष depolarization का परिणाम है या ंयूरॉंस के depolarization से परिणाम एल कोशिकाओं या प्रभाव के करीब है इसके साथ ही जारी किया गया पार्करइन उत्तेजक उत्तेजकों/ perfused आंत का उपयोग कर अध्ययन से उत्पन्न होने वाले डेटा जो आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए लक्ष्य होना चाहिए, इसलिए, हमेशा अन्य अधिक विशिष्ट मॉडल से प्राप्त डेटा के साथ संदर्भ में रखा जा करने के लिए स्थापित करने की क्षमता में वृद्धि भिन्न. उदाहरण के लिए, ग्लूकोज-उत्तेजित जीएलपी-1 स्राव से glp-1 स्रावित कोशिका लाइन glutag28,29 और प्राथमिक माउस से एल-कोशिकाओं ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि पर निर्भर करता है (SGLT1 and GLUT2). perfused चूहा छोटी आंत में इन ट्रांसपोर्टरों को अवरुद्ध भी जठर20attenuates, जिसका अर्थ है कि यह संभावना है कि ग्लूकोज-उत्तेजित glp-1 स्राव काफी हद तक एल सेल पर ग्लूकोज की प्रत्यक्ष क्रियाओं द्वारा मध्यस्थता है. पृथक perfused आंत की एक और महत्वपूर्ण सीमा है कि लिपिड के कुछ उनके हाइड्रोफोबिसिटी के कारण अध्ययन करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं । हालांकि यह लिपिड पाचन के अंतिम उत्पादों की जांच करने के लिए संभव है (फैटी एसिड, diacyl ग्लिसरीन, lysophosphatidylglycerols, आदि) और हालांकि तैयारी फिर से करने में सक्षम हो सकता है-लिपिड्स intra esterify और शायद उन्हें में पैक chylomicrons, कोशिकाओं से बाहर chylomicrons के परिवहन और उनके बाद की lacteals द्वारा आगे की तेज विली बाधित है, के बाद से अलग आंत में लिम्फ प्रवाह को सुरक्षित नहीं किया जा सकता है । सबसे अधिक संभावना है, इसलिए, लिपिड अवशोषण एक बार अवशोषित उत्पादों को कोशिकाओं में जमा करने के लिए शुरू रुक जाता है । इन विट्रो सेल सिस्टम भी कम है क्योंकि उनके ध्रुवीकरण की कमी के लिपिड अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं । जाहिर है, इस सीमा केवल लिपिड कि अवशोषित कर रहे हैं और lacteals के माध्यम से ले जाया जाता है के लिए प्रासंगिक है, आंतों रक्त वाहिकाओं के माध्यम से अवशोषित उन जबकि सामान्य रूप से संभाला जा करने की संभावना है.
Protocol
Representative Results
Discussion
पृथक perfused चूहा छोटी आंत एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है कि गतिशीलता और आणविक आंत हार्मोन स्राव अंतर्निहित तंत्र विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है । इस मॉडल के साथ डेटा के सफल उत्पादन के लिए सबसे म?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थन किया गया था प्रो जेंस मूल चयापचय अनुसंधान (नोवो nordisk फाउंडेशन, डेनमार्क), के लिए novo nordisk फाउंडेशन से एक अलग अनुदान के लिए novo nordisk केंद्र से कृंतक परफ्यूजन अध्ययन (अनुदान सं । NNF15OC0016574), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान सं 695069) और अनुसंधान, प्रौद्योगिकीविकास, और प्रदर्शन गतिविधियों (अनुदान no. २६६४०८) के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक postdoc के लिए सातवीं रूपरेखा कार्यक्रम से प्रो holst के लिए एक अनुदान लुंडबेक फाउंडेशन (R264-2017-3492) से रूण ई. कुहरे को अनुदान । हम सावधान प्रूफरीडिंग के लिए jenna ई. हंट और कैरोलिन एफ deacon धंयवाद ।
Materials
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
Referências
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