免震を用いた消化管ホルモン分泌のメカニズム潅流ラット小腸
Summary
ここでは、消化管ホルモンの分泌と消化管吸収の分子機構を研究する強力な生理学的モデルを提案-単離灌流ラット小腸。
Abstract
腸は、食欲と食物摂取、消化、栄養の吸収と配布、および食後血糖値ツアーを規制する 15 以上の異なるペプチド ホルモンを作り出す体の最大の内分泌臓器です。消化管ホルモンの分泌を調節する分子機構の解明、理解し、消化管ホルモンの生理学の翻訳のための基礎。従来、消化管ホルモン分泌のメカニズム (実験動物または人間) の in vivo 研究されているいずれかまたは粘膜腸ホルモン分泌プライマリを使用して細胞培養細胞します。消化管ホルモン分泌の研究のための代替方法として単離灌流ラット小腸を紹介します。このモデルの美徳は、それはほとんどの重要な生理学的パラメーター粘膜偏波、パラクリン関係のルートなど生体内での研究での分泌を担当を繰り返す意味、そのまま腸に依存します。灌流/刺激の露出。さらに、生体内での研究とは異なり、単離灌流ラット小腸、ほぼ完全に実験的制御と分泌を直接評価します。In vitro 試験と対照をなしてそれは大きさと分泌の重要な質問、どのような刺激を引き起こす腸内腔 (血管) のどちらの側からの分泌は、異なる消化管ホルモンの分泌などに力学の両方を研究することが可能刺激、分泌反応の基になる詳細分子センサーで分析します。さらに、準備は、腸管吸収および責任のトランスポーターを含む腸管の吸収動態に関する詳細の調査のための強力なモデルです。
Introduction
腸は、体の養分吸収と栄養素の処分、腸の成長を調節し、食欲1を調節する 15 以上の異なるペプチド ホルモンの生産最大の内分泌臓器です。消化管ホルモンは多くの基本的な生理学的なプロセスに関与している、したがってと我々 の基本的な生理学的に重要な分泌の分子の詳細はそれぞれのホルモンの分泌を制御するこれらのパターンを理解すること、理解と腸ホルモン操作の並進の側面に対処するためしかし、どのように 1 つは消化管ホルモンの分泌分子センシング機構を学ぶことができますか。一般に、ホルモン分泌の分離腸準備や消化管ホルモン分泌一次電池文化からそのまま生物 (人間または動物実験) で学ぶことができますまたは不死化細胞文化2,3,4,5,6私たちの推奨モデルが最適な時間分解能 (任意の時間で料金を決定ことができます分泌物を詳細に検討する消化管ホルモンの分泌ができる関連する生理学的モデルは、単離灌流ラット小腸。基本秒単位まで) な結果になると体内の状況7に譲渡。ここでは、この手順を実行する方法の詳細なプロトコルを提供して我々 が、利点および単離灌流ラット小腸と比較してこれらのモデルの制限を含む消化管ホルモンの分泌を勉強するための他の方法に説明します。
1 つは、特定の化合物が特定の消化管ホルモンの分泌を調節するかどうかを確立したい、人間の調査が究極の目標です。したがって、化合物 (生体または perfusions) で齧歯類の 1 つまたはいくつかの消化管ホルモンの分泌に大きな効果を示して 場合、ホルモンから分泌細胞 (細胞または細胞) この効果のみ医学と人体生理学に関連する場合が確認できます。人間。ヒトでは、実行することができます研究のタイプの明確な限界があるし、実験動物の生体内での研究は、したがって、多くの場合このような研究の 2 番目の最高のオプションです。マウスやラットは、便利なサイズ、低コスト、特定の調査の質問に関与している疑いがある遺伝子を遺伝的に変更するためのオプションのためにおそらく最も頻繁に使用される実験動物 (など特定の運送者のノックアウトまたは受容体)。一般に、体内のモデルは、生理学的にそのままであることから恩恵を受けるもいくつかの制限があります。齧歯動物、特にマウスの小型は制限要因である腸ホルモン定量化のためほとんどの試金は少なくとも 20 μ L を必要と最も重要なは、少なくとも意味プラズマ (、はるかに多く) 複製を作り撤退するが血の 100 μ L定量化。したがって、基準サンプルに対応する非常に少数のサンプルと (20 g のマウスの総血液量は ~1.4 mL) 1 つまたは 2 つの後刺激サンプルを入手することが可能です。その結果、潜在的な分泌応答 (例えば、急速にまたは遅く起こる応答) 乗り遅れたことがあります。
灌流モデルでこの問題を克服するため、大規模なサンプルとしてボリュームが得られる (流量: 7.5 mL/分)、短期間の急速な応答が逃されないということを確認するため必要に応じて、収集間隔を調整ことができます (我々 の収集分毎サンプル)7.別の問題齧歯動物の生体内研究ではほとんどの消化管ホルモンがさらに多く急速に削除または人間8,9,10、その後の生化学的分析を複雑にするかもしれないより代謝します。例えば、我々 は示した GLP 1 は人間のよりもさらに高速の速度でマウスで代謝されること (T1/2 1-2 分11) より重要なは、N 末端で胸の谷間だけでなく、GLP 1 のマウスの胸の谷間を含むジペプチジルペプチダーゼ-ペプチダーゼ-4 (DPP4) (ある主要な人間の GLP-1 分解酵素)、酵素の中性エンドペプチダーゼ 24.1112で胸の谷間をさらに。その結果、GLP-1 (7 36amide) のままのアイソ フォームまたは DPP 4 切断アイソ フォーム (9-39amide) に基づいているか、GLP-1 の定量化のため現在商業の試金は大幅にマウスにおける GLP 1 分泌を過小評価および結果の12. 単離灌流ラット小腸で分泌されたホルモンの代謝のほとんどは削除またはプラズマによる劣化は避け、肝臓、腎臓、肺抽出/劣化防止 (ので、著しく減少しています。出納を回収して腸から離れるにつれて)。
もちろん、遺伝子組み換え動物、例えば、ナトリウム-グルコース輸送体 1 ノックアウト マウス13の使用によって生成される重要な洞察が、しばしば分泌に関与する分子センサーの詳細な評価が必要です。細胞内タンパク質を異なる G タンパク質共役受容体からイオン チャネル分子の輸送に至るまで、複数の分子サイトの考察。たとえば、9 つの異なる分子サイトの活動は、分子センサー グルコース刺激 GLP 1 分泌7担当を解くとき対象と。同様の調査は、できるだけ体内の化合物のいくつかが非特異的または有害/致死効果ないでしょう。例えば、灌流の腸を使用している場合は、役割と同様に、2-4-ジニトロフェノール7,14 ATP 形成をブロックすることにより GLP 1, ニューロテンシンの分泌の細胞内グルコース代謝の役割を評価することが可能だった胆汁酸の電位依存性カルシウム チャネルは、GLP 1、NT および PYY の分泌3を刺激しました。確かに、灌流研究の非常に有毒なナトリウム チャネルのブロッカー テトロドトキシンを正常に適用できます。最後に、灌流モデルで直接評価できます。 どこ腸内で特定の化合物分泌を刺激するある特定のホルモンの調査官が単に選択し、灌流して目的の地域を準備し、同時に調べることができます。かどうか刺激は腸3,15,16の内腔または血管側から分子センサーの活性化によって分泌を引き起こします。
基になる消化管ホルモンの分泌は、によって学ぶことができる分泌のメカニズムは (人間の組織を含む)、腸組織部分の腸によって (、マウス、または人間の起源)、細胞を分泌不死化 (マウス) から通常のプライマリ腸の文化ホルモンを使用します。組織では、Ussing 室、(最も頻繁にマウスからの両方) organoids2,3,4,5,6,17,18をマウントされています。もちろん腸の部分の研究新鮮な人間の腸内へのアクセスが必要ですが、ひと腸内作品, 一次電池文化および細胞株に関する技術的に簡単に実行する、データを生成するより速くより安い方法腸 perfusions と比較して、標本。しかし、これらのモデルで、腸内の正常な細胞の分極は本質的に失われ、分子センサーの通常の活性化を評価するためにこれらのモデルを使用ことはできません吸収過程も調査することができないことを意味します。さらに、このような研究は通常静的な孵化を採用 (のいくつかの時間まで) は生理学的高度と分泌製品は削除されず、このようにフィードバックに影響を与える可能性がありますので、細胞の通常の分泌動態とは何もして、ホルモンの分泌。対照的に、灌流腸内分泌および吸収分子効率的に削除され、粘膜の微小循環体内、吸収と分泌の正常な率で発生することがので、経勾配が維持されていることを確認彼らは。つまりネイティブ細胞ペプチド コンテンツ面での代表的な分子センサーの表現であるもはや彼らはまだ可能性がありますが、ネイティブの enteroendocrine 細胞の起源から培養細胞がさらに、脱分化型問題のホルモンを分泌します。これは、例えば、GLP 1 分泌細胞ライン19のためのケースです。
それは、したがって、我々 の意見を一次電池文化またはセル行研究、スクリーニング目的のため生体内で実行することはできませんの種類の実験を実行するためや分離の灌流腸内で最も適しています。例えば、一次電池文化および培養細胞ラインの真の強さはその細胞内二次メッセンジャー (例えば Ca2 +キャンプ、NAD(P)H) をリアルタイムで監視できるし、ホルモン分泌細胞の電気信号は、20,21,22を調べた。さらに、その特異的阻害剤が利用可能な20,21,22,23,24ではない場合に特に便利である、siRNA の打撃が実行できます。Ussing 室でマウントされているマウスから腸のティッシュは、(マウス) から腸 organoids 中、胆汁酸刺激 GLP 1 分泌の分子機構を研究するため最近使用されており、人間の腸内の作品は、勉強のため使用されている、消化管ホルモン分泌17,25の分子の詳細。2円偏波であることから元の利点に対しすべてのこれらのモデルは静的な孵化を含みます。ただし、組織 7TM 受容体発現における種差以来重要である齧歯動物というよりも、人間のティッシュを使用して恩恵を人間の腸内の作品に関する研究、分子トランスポーター可能性があります異なる分子センシング経路種。実際には、このフィールドのほとんどのデータは、ブタ、マウス、ラットのいずれかに関する研究によって生成されている、これらの知見は、人間に転送できるかどうか、それはとらえどころのないまま。です、ただし、グルコース刺激 GLP 1 分泌の根底にある分子の検出機構は、マウス、ラット、男、間に似ている、安心とトランスクリプトームと peptidomic のプロファイリング マウス L 細胞の明らかに強いグローバル2 種7,18,26,27間の類似点。
単離灌流ラット小腸しかし、考慮すべきいくつかの制限があります。最も重要なは、標的ホルモン産生細胞の被験物質で直接活性化は、間接メカニズムによってというか原因が与えられた分泌反応に起因するかどうかを確認するは不可能です。例えば、KCl は即座に7の灌流腸から GLP 1 分泌を増加させるが、この L 細胞の直接脱分極の結果や L 細胞に近いニューロンの脱分極またはの効果に起因かどうか不明のままパラクリン刺激/阻害剤を同時発売。灌流の腸を使用して分泌の分子機構の解明を目指す研究から生じるデータする必要があります、したがって、常にコンテキストに配置するを確立する能力を高めるための他のより特定のモデルから取得したデータで因果関係。例えば、GLP 1 分泌細胞株 GLUTag28,29とプライマリ マウス L 細胞からのグルコース刺激 GLP 1 分泌はブドウ糖の運送者 (SGLT1、GLUT2) のアクティビティに依存します。分泌20L 細胞のグルコースの直接行動による主グルコース刺激 GLP 1 分泌する可能性があることを意味を減衰も灌流ラット小腸におけるこれらのトランスポーターをブロックします。灌流、腸のもう一つの重要な制限は、脂質の一部が、疎水性のための勉強は難しいことです。脂質消化 (脂肪酸、前記ジアシル リン、lysophosphatidylglycerols、等) の最終製品を調査することはできますが、準備が再エステル化することがありますが、脂質内 cellularly、おそらくそれらをパックにチロミクロン、細胞とその後続 lacteals 絨毛の吸収、チロミクロンの輸送が中断される分離腸のリンパの流れを確保できないので。ほとんどの場合、したがって、吸収製品が細胞内に蓄積する始めれば、脂質吸収が停止しました。体外電池システムは、偏波の欠如のためさらに少ない脂質研究に適しています。明らかに、この制限は、脂質吸収され、lacteals 経由にのみ関連、それらは腸の血管を介して吸収されるに対し、正常に処理される可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
単離灌流ラット小腸は、ダイナミクスと分子機構の詳細に検討する消化管ホルモンの分泌を可能にする強力な研究ツールです。このモデルを使用してデータの巧妙な生産の最も重要なステップは、手術操作です。腸の処理は、必然的に腸にいくつかの損傷を引き起こすし、そのために維持されるべき絶対最小。さらに重要なは、操作の速度は上腸間膜動脈内カテーテル留置のための時間に関?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業によって支えられた無制限で与える教授 Jens におけるホルストにノボ ノルディスク センターから基本的な代謝研究 (ノボ ノルディスク財団、デンマーク) (許可なし齧歯動物の血流の研究を行ってのノボ ノルディスク財団から別の助成金。NNF15OC0016574) 教授ホルストに欧州研究評議会 (グラント no.695069) と欧州連合からの助成金のポスドクと同様、研究、技術開発、実証活動 (許可番号 266408) に第 7 フレームワーク プログラムルンドベック財団 (R264-2017-3492) からルーン E. Kuhre に付与します。注意して校正、ジェナ e. ハントとキャロリン ・ f ・執事に感謝します。
Materials
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
Referências
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