창 자 호르몬 분 비는 격리를 사용 하 여 기본 메커니즘 끼얹는다 쥐 소장
Summary
여기, 우리는 기본 창 자 호르몬 분 비 및 장내 흡수 분자 메커니즘 연구에 강력 하 고 생리 적 모델 제시-격리 끼얹는다 쥐 소장.
Abstract
용기는 식욕과 음식 섭취, 소화, 영양소의 흡수와 분포, 및 포스트 높은가격순 포도 여행 15 개 이상의 다른 펩 티 드 호르몬을 생산 하는 신체의 가장 큰 내 분 비 기관 이다. 창 자 호르몬 분 비를 조절 하는 분자 메커니즘을 이해 하는 것은 이해 하 고 소화 관 호르몬 생리학 번역에 대 한 기본적 이다. 전통적으로, 기본 창 자 호르몬 분 비 메커니즘 (실험 동물 또는 인간)에서 vivo에서 공부 하거나 또는 문화 셀 또는 셀 라인 점 막 창 자 호르몬 분 비 기본을 사용 하 여. 여기, 창 자 호르몬 분 비를 공부 하기 위한 대체 방법으로 격리 된 끼얹는다 쥐 소장을 소개 합니다. 이 모델의 미 덕은 그것은 생리 적으로 중요 한 매개 변수 vivo에서 학문, 점 막 분극, paracrine 관계의 노선 등에서 분 비에 대 한 책임의 대부분을이 의미 그대로 직감에 의존 관류/자극 노출입니다. 또한, 그리고 vivo에서 연구와는 달리 거의 완전 한 실험 제어 및 분 비의 직접 평가 대 한 격리 끼얹는다 쥐 소장 수 있습니다. 달리 생체 외에서 학문, 그것은 크기와 주소 중요 한 질문, 어떤 자극 원인 용기 (luminal 또는 혈관)의 측면에서 분 비는 다른 소화 관 호르몬의 분 비와 분 비의 역학을 공부 하 자극, 분 비 응답 기본 세부 분자 센서에서 분석 하 고. 또한, 준비 책임 전송기를 포함 하 여 장내 흡수의 역학에 관한 내용과 장내 흡수의 연구에 대 한 강력한 모델입니다.
Introduction
용기는1식욕 조절 영양소의 흡수 및 영양 처리, 장 성장 규제 15 개 이상의 다른 펩 티 드 호르몬을 생산 하는 신체의 가장 큰 내 분 비 기관 이다. 창 자 호르몬, 따라서, 많은 기본적인 생리 적 과정에 참여 이며 분 비와 각 호르몬의 분 비를 제어 하는 분자 세부의 이러한 패턴을 이해 따라서 우리의 기본 생리에 대 한 중요 한 이해 하 고 소화 관 호르몬 작업;의 변환 측면을 해결 하기 위한 하지만 어떻게 하나 밑에 창 자 호르몬 분 비 분자 감지 메커니즘을 공부할 수 있습니다? 일반적으로, 호르몬 분 비 절연된 용기 준비 또는 창 자 호르몬 분 비 1 차 셀 문화에서 그대로 유기 체 (인간 또는 실험 동물), 공부 될 수 있다 또는 셀 문화2,3, 를 불멸 하 게 4 , 5 , 6. 우리의 선호 모델은 격리 끼얹는다 쥐 소장, 최적의 시간 해상도 (분 비 속도 든 지도 결정 될 수 있다 자세히 공부 창 자 호르몬의 분 비를 허용 하는 생리 적으로 관련 모델 두 번째도 기본), 결과 가능성이 vivo에서 상황7양도. 여기, 우리이 절차를 수행 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하지만 먼저 우리는 창 자 호르몬 분 비, 혜택 및 분리 끼얹는다 쥐 소장에 비해이 모델의 한계를 포함 하 여 공부를 위한 다른 방법을 논의할 예정 이다.
만약 하나의 소원을 특정 화합물 특정 창 자 호르몬의 분 비 조절 여부 설정, 연구 인간의 궁극적인 목표는. 따라서, 화합물 비보 나 (perfusions)에 설치류에 하나 또는 여러 개의 창 자 호르몬의 분 비에 좋은 효과 보여줍니다 또는 호르몬에서 분 비 세포 (세포 선 또는 1 차 셀),이 효과만 의학 및 인간 생리학에 관련 된 경우 확인할 수 있습니다. 인간. 그러나, 인간에서 수행할 수 있는 연구의 유형에 대 한 명확한 한계가 있다 그리고 vivo에서 연구 실험 동물에는, 따라서, 종종 이러한 연구에 대 한 최고의 두 번째 옵션. 생쥐와 쥐가 그들의 편리한 크기, 저렴 한 비용 및 유전자의 구체적인 연구 질문에 참여 하 고 의심 하는 유전자를 변경 하는 옵션 때문에 아마도 가장 자주 사용 된 실험 동물 (예를 들어, 특정 전송 밖 노크 또는 수용 체)입니다. 일반적으로, vivo에서 모델 순수 그대로 되 혜택 하지만 몇 가지 제한이 있다. 가장 중요 한 것은, 작은 설치류, 특히 마우스의 크기가 제한 요소, 창 자 호르몬 정량화에 대 한 대부분의 분석 요구 20 µ L 플라즈마 (그리고 종종 훨씬 더), 적어도 의미의 혈액의 100 µ L 복제 철회 되어야 하는 정량화입니다. 따라서, 그건 단지 거의 샘플 해당 기준선 샘플 하 고 하나 또는 두 개의 후 자극 샘플 (20 g의 마우스에 총 혈액 량은 ~1.4 mL)을 얻을 수 있습니다. 따라서, 잠재적인 분 비 응답 (예를 들어, 빠르게 또는 늦게 발생 응답) 따라서 놓칠 수 있습니다.
관류 모델에서이 문제를 극복, 볼륨 큰 샘플으로 가져온 (유량: 7.5 mL/min) 컬렉션으로 빠르고 짧은 지속 응답은 보고 되지 보장 하기 위해 필요에 따라 조정 될 수 있다 (우리는 수집 모든 분 샘플)7 . 또 다른 문제 설치류에서 vivo 연구에서 대부분 소화 관 호르몬은 더욱 빠르게 제거 또는 보다 인간8,9,10, 이후 생 화 확 적인 분석을 복잡 하 게 수 있는 대사. 예를 들어, 우리가 보여준 GLP-1은 인간에서 보다 더 빠른 속도로 쥐에서 물질 대사로 변화 (T1/2 는 1-2 분11)와, 더 중요 한 것은 N 맨끝 분열에 의해 뿐만 아니라 쥐에 GLP-1의 분열을 포함 하 dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (이 인 간에 있는 주요 GLP-1 타락 효소), 효소 중립 endopeptidase 24.1112분열을 추가. 도 GLP-1 (7-36amide)의 그대로 isoform 또는 기반 DPP-4 죽 습 isoform (9-39amide), GLP-1의 정량화에 대 한 현재 상업적인 분석 훨씬 쥐 분 비 GLP-1를 과소 평가 하 고 결과 오해의 소지가 발생할 따라서, 12. 격리 끼얹는다 쥐 소장에서 분 비 호르몬의 대사 대부분 제거 또는 현저 하 게 감소, 플라즈마 중재 저하를 피할 수 있기 때문에 (때문에 간/신장/폐 추출/저하를 방지 perfusate는 수집 용기를 떠날 때).
물론, 중요 한 통찰력은 유전자 변형된 동물, 예를 들어, 나트륨 포도 당 운송업 자 1 녹아웃 쥐13의 사용에 의해 생성 될 수 있습니다 하지만 종종 분 비에 관여 하는 분자 센서의 상세한 평가 필요 이온 채널 분자 전송기 및 다른 G 단백질 결합 된 수용 체 세포내 단백질에 이르기까지 여러 분자 사이트의 고려 사항. 예를 들어, 우리는 9 다른 분자 사이트의 활동 분자 센서 GLP-1 분 비 포도 당 자극7에 대 한 책임을 탈피 할 때 대상. 유사한 조사 가능한 vivo에서 사용 하는 화합물 중 일부는 불특정 또는 유해한 치명적인 효과 않을 것 이다. 예를 들어, perfused 용기를 사용할 때는 가능 했다의 역할 뿐 아니라 2-4-dinitrophenol7,14 ATP 형성을 차단 하 여 neurotensin GLP-1의 분 비에 대 한 세포내 포도 당 대사의 역할을 평가 하 담 즙 산에 대 한 전압 개폐 칼슘 채널 자극 GLP-1, NT 및 PYY 분 비3. 실제로, 높게 유독한 나트륨 채널 차단제 테트로도톡신 관류 연구에 성공적으로 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 관류 모델에 그것 평가 될 수 있다 직접 어디에 특정 화합물 자극 특정 호르몬의 분 비로 탐정 수 있습니다 간단 하 게 선택 하 고 perfuse, 원하는 영역을 준비 하 고 동시에 그것은 조사 수 있습니다. 여부는 자극 분자 센서의 활성화에 의해 내장3,,1516의 luminal 또는 혈관에서 분 비를 발생합니다.
기본 창 자 호르몬 분 비에 의해 공부 또한 수 분 비 메커니즘 사용 (인체 조직 포함), 창 자 조직 조각의 불후의 명작 (쥐)에서 일반적으로 기본 장 문화 호르몬 셀 라인 (마우스 또는 인간의 기원), 창 자에 의해 은닉 조직은 Ussing 약 실에서 또는 organoids (마우스에서 가장 자주 둘 다)2,3,,45,6,,1718거치. 장 perfusions에 비해, 인간의 직감 조각, 기본 세포 배양 및 세포에 대 한 연구 수행을 기술적으로 쉽게 데이터를 생성 하는 빠르고 저렴 방법 하지만 직감 조각의 연구 신선한 인간의 창 자에 대 한 액세스를 필요로 하는 물론 표본입니다. 그러나,이 모델에는 정상 세포의 양극 화 현상이 용기 분자 센서의 정상적인 활성화를 평가 하기 위해이 모델을 사용할 수 없습니다 고 흡수 프로세스 또한 공부 될 수 있는 본질적으로 손실 됩니다. 또한, 이러한 연구 결과 일반적으로 정적 외피 고용 (에 대 한 여러 h)는 매우 비 생리 적 이며 상관이 세포의 정상적인 분 비 역학, secreted 제품 제거 되지 않습니다 및 따라서 피드백 영향을 미칠 수 있기 때문에 호르몬의 분 비 반면, perfused 소장에서 분 비 및 흡수 분자는 효율적으로 제거 점 막 미세 혈관에 의해 vivo에서, transmucosal 그라디언트 흡수와 분 비는 정상 속도로 발생할 수 있습니다 그래서 유지 됩니다 보장은. 또한, 셀 문화 그들의 네이티브 enteroendocrine 셀 근원, 그들은 여전히 수 있지만 그들은 더 이상 펩 티 드 콘텐츠 측면에서 네이티브 셀의 대표 분자 센서, 표현의 의미에서 dedifferentiated 할 수 없습니다. 질문에 호르몬 분 비. 이것은, 예를 들어, GLP-1 은닉 세포 라인19에 대 한 경우입니다.
그것은, 그러므로, 우리의 의견 1 차 셀 문화 또는 셀 라인 연구는 심사 목적 및 수행 vivo에서 수 없는 형식 실험을 수행 하기 위한 또는 고립 된 perfused에 가장 적합. 예를 들어, 기본 세포 배양 및 세포 선 문화의 진정한 힘은 그 세포내 이차 메신저 (예: 캘리포니아2 +, 캠프, NAD(P)H)는 실시간으로 모니터링할 수 있습니다 그리고 수 있습니다 세포를 은닉 하는 호르몬의 전기 신호 20,,2122조사. 또한, siRNA 최저 할 수 있습니다, 특정 억제제 사용할 수20,,2122,,2324없는 경우에 특히 유용. 창 자 조직 Ussing 챔버에 장착 하는 쥐에서 최근 사용 되었습니다 담 즙 산 자극된 GLP-1 분 비, 장 organoids (쥐)에서 동안 기본 분자 메커니즘을 공부 하 고 인간의 직감 조각 또한 공부에 대 한 사용 되었습니다는 창 자 호르몬 분 비17,25의 분자 세부 사항. 반면 되 전 혜택 편광2 이러한 모델의 모든 정적 외피를 포함 한다. 그러나 인간의 직감 조각에 대 한 연구는, 설치류, 보다는 오히려 인간, 조직 7TM 수용 체의 조직 식에서 종 차이부터 중요 한을 사용 하 여 혜택 및 분자 운송업 자 다른 분자 감지 경로 사이 발생할 수 있습니다. 종입니다. 사실,이 분야에서 대부분 데이터 돼지, 쥐 또는 쥐에 대 한 연구에 의해 생성 되었습니다 하 고 이러한 연구 결과 인 간에 게 전송 될 수 있습니다 여부 애매 남아. 그러나 그것은,, 기초가 GLP-1 분 비를 자극 하는 포도 당 분자 감지 메커니즘 마우스, 쥐, 사람, 사이 비슷한 것 처럼 안심 하 고 transcriptomic 및 마우스 및 인간의 L-셀 프로 파일링 peptidomic 공개 강한 글로벌 2 개의 종의7,18,,2627사이의 유사성.
그러나 끼얹는다 고립 된 쥐 작은 창 자,, 또한 고려해 야 하는 몇 가지 제한이 있다. 가장 중요 한 것은, 주어진된 분 비 응답 결과에서 대상된 호르몬 생성 세포의 시험 물질에 의해 직접 활성화 또는 오히려은 인해 발생 하는지 확인 간접 메커니즘 수 아니다. 예를 들어, KCl는 즉시 perfused 내장7, GLP-1의 분 비를 증가 하지만 알 수 없는 남아 여부이 직접 도발은 L 셀의 결과 또는 L-세포 주변 신경의 도발은 또는 효과의 결과 paracrine 자극/저 해제를 동시에 발표 했다. Perfused 내장을 사용 하 여 기본 분 비 하는 분자 메커니즘을 명료 하 게 하는 연구에서 발생, 따라서 항상 넣을 수 컨텍스트 설정 하는 기능을 증가 하기 위하여 다른 더 구체적인 모델에서 얻은 데이터와 인과 관계입니다. 예를 들어, 포도 당 자극 GLP-1 분 비 및 기본 마우스 L 세포 GLP-1 은닉 셀 라인 GLUTag,2829 에서 포도 당 운송업 자 (SGLT1 및 GLUT2)의 활동에 따라 달라 집니다. 분 비20, GLP-1 분 비 포도 당 자극은 크게 L 셀에 포도의 직접 행동에 의해 중재 가능성이 다는 것을 의미를 약하게 또한 끼얹는다 쥐 소장에이 전송기를 차단. 격리 perfused 내장의 또 다른 중요 한 한계 지질 중 일부 그들의 hydrophobicity 인해 공부 하기 어려운 것입니다. 지질 소화 (지방산, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, 등)의 최종 제품을 조사 하 고 준비 다시 esterify 수 있습니다 있지만 지질 intra-cellularly 그리고 아마도 그들을 팩을로 chylomicrons, 세포와 그들의 후속 글귀는 villi의 lacteals에 의해 chylomicrons 전송 중단 됩니다 때문에 격리 된 림프 흐름을 보안 수 없습니다. 대부분, 따라서 지질 흡수 중단 됩니다 일단 흡수 제품 셀에 축적 하는 시작. 생체 외에서 셀 시스템은 지질 연구에도 덜 적합 분극의 그들의 부족 때문에. 물론,이 제한만 흡수 되 고는 lacteals 통해 전송 하는 지질에 대 한 관련, 그 창 자 혈관을 통해 흡수 하는 반면 정상적으로 처리 될 가능성이 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
격리 된 끼얹는다 쥐 소장 역학과 분자 메커니즘을 자세히 공부 하는 창 자 호르몬 분 비를 기본 허용 하는 강력한 연구 공구 이다. 이 모델을 사용 하 여 데이터의 성공적인 생산을 위한 가장 중요 한 단계는 수술입니다. 용기의 처리는 필연적으로 내장에 손상을 발생 하 고 그러므로 지켜져야 한다 절대 최소. 심지어 더 중요 한 것은, 작업의 속도 mesenteric 동맥에 카 테 테 르 배치에 대 한 시간에 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에 의해 지원 되었다 무제한 그랜트 교수 옌스 Juul 홀스트 하 Novo Nordisk 센터에서 기본적인 대사 연구 (Novo Nordisk 기초, 덴마크), Novo Nordisk 설치류 관류 연구 (no를 부여 하 고 재단법인에서 별도 부여에 대 한 NNF15OC0016574), 유럽 연구 위원회 (그랜트 no.695069) 및 theEuropean 조합에서 교수 홀스트에 부여의 한 postdoc로 7 프레임 워크 및 프로그램을 위한 연구, TechnologicalDevelopment, 논증 활동 (보조금 번호 266408) Lundbeck 재단 (R264-2017-3492)에서 룬 E. Kuhre를 부여 합니다. 우리 주의 교정에 대 한 제 나 E. 헌트와 캐롤 린 F. 디 감사합니다.
Materials
| Chemicals for perfusion buffer | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 1.12018.0500 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O) | Merck | 102382 | |
| Dextran 70 | Pharmacosmos | 40014 | |
| Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4) | Sigma Aldrich | F9642 | |
| Glucose (C6H12O6) | Merck | 108342 | |
| Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4) | Merck | 105886 | |
| Potasium chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck | 104873 | |
| Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4) | Merck | 106619 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | ||
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O) | Merck | 106445 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion equitment | |||
| Universial perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | |
| BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm | Harvard Bioscience, Inc. | 733313 |
Referências
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