Vi præsenterer her, hvordan lille vinkel X-Ray spredning (SAXSA) kan udnyttes til at få oplysninger om lav opløsning konvolutter repræsenterer de makromolekylære strukturer. Når det bruges sammen med høj opløsning strukturelle teknikker såsom røntgenkrystallografi og Kernemagnetisk resonans, kan SAXSA levere nærmere indsigt i flere domæner proteiner og makromolekylære komplekser i-løsning.
Protein-protein interaktioner, der vedrører proteiner med flere kugleformede domæner nuværende tekniske udfordringer til at bestemme hvordan sådan komplekser form og hvor domænerne er orienteret/placeret. Her, er en protokol med potentiale for belyse hvilke specifikke domæner mægle samspillet i stand system gennem ab initio modellering beskrevet. En metode til beregning af løsning strukturer af makromolekyler og deres forsamlinger er forudsat, der involverer integration af data fra lille vinkel X-ray spredning (SAXSA), kromatografi og atomic opløsning strukturer sammen i en hybrid tilgang. Et konkret eksempel er komplekset af fuld længde nidogen-1, som samler ekstracellulære matrix proteiner og danner en udvidet, buede nanostrukturer. En af dens kugleformede domæner tillægger laminin γ-1, som strukturer basalmembranen. Dette giver et grundlag for fastlæggelse af præcise strukturer af fleksible flere domæner proteinkomplekser og aktiveres af synkrotron kilder kombineret med automation robotteknologi og størrelse udstødelse kromatografi systemer. Denne kombination giver mulighed for hurtig analyse, hvor flere oligomere stater er adskilt lige før SAXSA dataindsamling. Analysen giver oplysninger om radius gyration, partikel dimension, Molekylær form og interdomain parring. Protokol for at skabe 3D-modeller af komplekser ved montering med høj opløsning strukturer af komponent proteiner er også givet.
Celler indeholder indviklet netværk af proteiner, der fungerer som molekylære maskiner til at udføre cellulære funktioner såsom signalering kaskader og opretholde strukturel integritet. De måder, hvorpå disse forskellige komponenter flytte og interagere i tredimensionale rum giver anledning til de specifikke funktioner i makromolekyler. Betydningen af protein struktur, dynamik og interaktioner ved fastsættelsen af funktion har givet behovet for løbende udvikling, komplekse teknikker til at måle disse egenskaber. Af disse, Kernemagnetisk resonans (NMR), røntgenkrystallografi (XRC) og mere for nylig, Cryo-Elektron Mikroskopi (CEM) informere høj opløsning strukturelle. Men XRC og CEM udbytte af en af mange stater, biomolekylære strukturer og mangler oplysninger om dynamikken af protein struktur, mens 3D-struktur bestemmelse af NMR er typisk begrænset til mindre kugleformede proteiner. En måde at overvinde disse begrænsninger er at udnytte lille vinkel X-Ray spredning (SAXSA) for at generere molekylære konvolutter af store, flere domæner eller kompleksbundet systemer, og kombinere de med høj opløsning stive makromolekylære strukturer for at belyse den globale arkitektur og dynamiske funktioner.
SAXSA producerer lav opløsning konvolutter af makromolekylære komplekser med en opløsning på ca 10-20 Å 1, give indsigt ikke kun i struktur, men også de dynamiske egenskaber, at komplekset viser. Selvom SAXSA udnytter røntgenbilleder for at afdække molekylære struktur, er det i modsætning til XRC i den tilfældige isotropic orientering af partikler i opløsningen ikke fører til diffraktion, men snarere at spredning, som ikke kan give atomic opløsning. I stedet, en elektron “kuvert” af makromolekyle genereres som repræsenterer et gennemsnit på med konformationer som makromolekyle viser. Denne information kan bruges i direkte montering af tidligere løst atomic opløsning strukturer for at udlede regioner af fleksibilitet i en enkelt protein eller underenhed organisation eller dynamik i en større, multi protein kompleks. SAXSA data er indsamlet på synchrotrons ved hjælp af højenergi monokromatiske stråler eller fra interne kilder, som giver en svagere røntgenstråler kilde der kræver timer i stedet for sekunder af prøven eksponeringstid (figur 1). SAXSA data er ofte indsamlet fra flere prøver med en enkelt eksperimentel opsætning og buffer, der kræver længere tid til at indsamle en runde af nyttige data på et system. Prøver skal derfor være stabile og ikke-sammenlægning i mindst et par timer baseret på verificerbare kvalitetskontrol metoder såsom dynamisk lysspredning (DLS) og/eller analytisk ultracentrifuge (AUC) analyse at opnå høj kvalitet SAXSA data2 , 3. her vi give en praktisk beskrivelse af SAXSA, principperne bag dens skik, fordele, begrænsninger og forberedelse af prøver og fokusere stærkt på dataindsamling og analyse, langs med rørende kortvarigt på ab initio modellering ved hjælp af den ekstracellulær matrix proteiner nidogen-1 og laminin γ-1 som en eksperimentel eksempel.
Principper, fordele og begrænsninger af SAXSA:
Den vejledende principle(s) bag SAXSA er relativt enkel: en løsning af monodispersed forberedelse af macromolecule(s) af interesse er placeret inden for en kapillær og er udsat for en høj energi monokromatiske X-ray stråle. Fotonerne medføre elektroner i den atomare shell til at begynde, oscillerende, resulterer i en sfærisk bølge bliver udledt af den samme energi og bølgelængde. Da hver elektron vil svinge, en konstant baggrund vil blive nået, og den resulterende elektron tæthed af makromolekyle er kontrast til baggrunden. Den deraf følgende spredning intensitet er indsamlet som en funktion af scattering vinkel, 2Θ (figur 1).
Mens andre teknikker såsom XRC, NMR og CEM giver strukturelle oplysninger på det atomare niveau, er der flere fordele til SAXSA, at andre teknikker ikke kan give. SAXSA kan udføres i næsten enhver buffer og kræver ikke nogen speciel prøveforberedelse. Dette er især vigtigt at studere adfærd og struktur af makromolekyler under varierende forhold såsom tilstedeværelsen eller fraværet af mono – eller divalent kationer eller ændringer i pH4,5. SAXSA har evnen til at give oplysninger om fleksible regioner et makromolekyle6, noget de andre børsnoterede teknikker kan kæmper med. Derfor kan SAXSA bruges som en stærk gratis teknik med de stabile dele af et makromolekyle, der studerede med XRC, NRM eller CEM, og den hele makromolekyle eller komplekse analyseres i lav opløsning med SAXSA og kombineret med forskellige analyseværktøjer sådanne som FoXSDock7 eller CRYSOL8. Da SAXSA er en løsningsteknik, er det ofte bruges til at bekræfte, hvis statisk strukturer som dem, der opnås fra XRC er konsekvent i løsning6. SAXSA har også fordelen at være en teknik, der kræver en forholdsvis lille mængde af prøven investeringer (typisk 50-100 µL) og en relativt lille eksperiment tid (30 min – 1 h).
Den største begrænsning af SAXSA er sårbarhed for prøven sammenlægning og/eller forringelse, som kan føre til forkerte strukturelle forudsigelser. En sammenlægning, selv så lavt som 5%, kan sprede lys i meget store mængder, hvilket fører til en overvurdering af maksimal partikel dimension (Dmax) og radius af gyration (Rg). På den anden side kan prøve nedbrydning føre til en undervurderes af molekylære egenskaber. Denne sårbarhed skyldes SAXSA er en gennemsnitsberegning teknik, hvilket betyder at prøve ensartethed er afgørende for at opnå pålidelige og reproducerbare resultater. Enhver proeve, der skal analyseres ved SAXSA underkastes derfor flere metoder til rensning og kontrol, homogenitet, denaturering og indfødte gelelektroforese, størrelse udstødelse kromatografi, dynamiske lys spredning, og analytiske ultracentrifugering. Ofte, vil SAXSA beamlines køre prøver gennem high-performance væskekromatografi som en sidste kvalitetskontrol trin før SAXSA (S-SAXSA)3,9. SAXSA data bør indsamles på flere koncentrationer og Rg af hvert datasæt skal sammenlignes, at sikre en tæt lighed for at undgå interparticle interaktioner og sammenlægning, hvilket resulterer i en overvurdering af partikel dimensioner, fører til unøjagtige dataanalyse og modellering. Da spredning afhænger af både koncentration og størrelse, kan mindre makromolekyler kræver en mere specifik optimering af koncentrationsområde. Dette er på grund af den Gensidighed teorem, hvor store størrelser scatter mod små vinkler og små størrelser mod store vinkler. Dette manifesterer sig i dataindsamling, hvor jegO er proportional med R6, hvor R er partikel radius. En endelig begrænsning af SAXSA er potentialet for strålingsskader på prøven under eksponering, hvilket kan føre til fordrejning af dataene. Det er god praksis at sammenligne prøve kvalitet, før og efter SAXSA prøve eksponering for det ikke sker.
Kritiske trin i SAXSA dataanalyse skitseret i afsnittet protokol i dette papir Medtag buffer subtraktion, Guinier analyse, Kratky analyse, data fusionerende og P(r) distribution. Ab initio perle modellering er alt for omfattende til at blive dækket her i detaljer og omtales derfor kun kortvarigt.
På synchrotrons (f.eks. DESY i Tyskland, diamant i Det Forenede Kongerige og ESRF i Frankrig), er det muligt at indsamle SAXSA data til en meget lille brøkdel (~ par µL) af hver prøve som fraktioner er at være elueres fra kolonnen s er tilsluttet i-line (Se figur 1 ). Elastisk spredte SAXSA data er radialt i gennemsnit bruger de pakker, der leveres af instrumentets fabrikant eller af synkrotron før buffer subtraktion kan finde sted. Den resulterende 1D data repræsenterer mængden af spredt lys (i, jeg(q)) på Y-aksen og scattering vinkel (q= 4πsinθ/λ, hvor λ er bølgelængden af hændelsen X-stråler) og er skitseret i figur 1. Programmet PRIMUS/qt12 bruges til at trække direkte fra enhver form for baggrundsviden på grund af buffer og er beskrevet i afsnit 1.1. Andre programmer såsom; ScÅtter43 (download til rådighed på www.bioisis.net) med en tilgængelig på https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, og bioXtas rå44 (tilgængelig på https:// tutorial bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) kan udnyttes som et alternativ til pakken ATSAS.
Guinier analysen giver oplysninger om prøven sammenlægning og homogenitet samt give Radius Gyration (Rg) for makromolekyle af interesse baseret på SAXSA data fra lav s regionen14. Et plot er konstrueret med PRIMUS/qt for SAXSA data indhentet fra hver koncentration, efterfulgt af kurven fitting med den maksimal rækkevidde på op til 1,30 for q x Rg. En monodispersed prøveforberedelse bør give en lineær Guinier plot i denne region (figur 2D), der henviser til, at sammenlægningen resultater i en ikke-lineær Guinier plot15,16. Hvis Guinier analysen er lineær, kan graden af “unfoldedness” af et makromolekyle interesse observeres med Kratky plot, hvilket er nyttigt, når der træffes beslutning om at udføre stive organ modellering eller konstruere ensembler af lav opløsning modeller. En kugleformede protein vises i et Kratky plot om at have en klokkeformet kurve, forlaenget molekyler eller udfoldet peptider vises at plateau eller endda øge i rækken større q og mangler bell-formen (figur 2 c).
At opnå Rg fra Guinier analyse kun mener datapunkter fra regionen lav q 1 D scatter plot (figur 2D), men det er muligt at bruge næsten hele datasættet til at udføre en indirekte Fourier transformation at konvertere de gensidige-plads oplysninger af ln (I (q)) vs (q) i en reel plads afstand distribution funktion (P(r)) som giver information om Dmax og Rg (Figur 2B) Form af handlingen P(r) repræsenterer brutto løsning kropsbygning af makromolekyle interesse18,19. konvertering af gensidige-space data til real-space data er et kritisk skridt men en detaljeret beskrivelse er ikke omfattet af dette papir. Derfor henvise til en artikel af Svergun20 at forstå hver parameter.
Når bufferen trækkes data i individuelle koncentrationer behandles via Guinier analyse med en konsekvent værdi for Rg, efterfulgt af undersøge deres folde mønster ved hjælp af Kratky analyse, disse data kan flettes. De flettede data er for nidogen-1, laminin γ-1, og deres komplekse blev behandlet som beskrevet ovenfor og den resulterende P(r) grunde præsenteret i figur 2B. Ideelt set bør man også beregne par-afstand fordelingsfunktion P(r) for hver koncentration at afgøre, om SAXSA data indsamles for hver koncentration giver lignende Rg og Dmax værdier. Hvis Rg og Dmax forbliver lignende over en bred vifte af koncentrationer, skal så brugeren fortsætte. Det skal bemærkes, at afhængigt af signalet, kan afkortes data før data sammenlægning. Dette er ofte tilfældet hvis koncentrationer og/eller molekylvægt af makromolekyler under undersøgelsen er lav.
Lav opløsning figur analyse ved hjælp af DAMMIN kan udføres i forskellige tilstande (f.eks. hurtig, langsom, ekspert tilstande, osv.). Den hurtige tilstand er en ideelle første skridt til at evaluerer hvis P(r) plottet giver god kvalitet modeller. Typisk bør mindst 10 modeller opnås for hver P(r) plot til at kontrollere, hvis der opnås reproducerbare resultater, strukturelt med lav opløsning med en lav godhed af fit parameter kaldet χ (en værdi på 0,5-1,0 anses for god baseret på vores omfattende arbejde ), en værdi, der beskriver en aftale mellem eksperimentelt indsamlede SAXSA data og model-afledte data. Publikation formål, vi typisk bruger langsom eller ekspert mode og beregne mindst 15 modeller. Ud over DAMMIN, en hurtigere version af det, DAMMIF37, samt GASBOR38 er også alternativer. Derudover for at studere protein-protein eller protein-nucleic acid komplekser, er det muligt at bruge den MONSA program35, som letter samtidige montering af den enkelte SAXSA data for både makromolekyler samt deres kompleks. For flere detaljer med høj opløsning modelberegninger samt for RNA-protein interaktion undersøgelser, henvise til en nylig artikel af Patel et al3.
SAXSA er teoretisk enkle, men uden tvivl en meget komplementære metode til andre strukturbiologi værktøjer og resultater i lav opløsning strukturelle data, der kan bruges alene eller sammen med høj opløsning teknikker til at belyse oplysninger om makromolekylære struktur og dynamik. Så længe en monodispersed forberedelse af makromolekyler og deres komplekser kan fås, kan SAXSA udnyttes til at studere i løsning struktur og interaktioner af enhver form for biologiske makromolekyle. For komplekset diskuteret her, det er bemærkelsesværdigt, at mindre end 10% af den samlede tilgængelige areal af kvælstof-1 og laminin γ-1 er begravet i dette kompleks, der henviser til, at resten af domæner af begge proteiner er frit tilgængeligt til at interagere med andre proteiner på den ekstracellulære matrix til at opretholde sin strukturelle stivhed (figur 3). At opnå sådanne oplysninger for et kompleks med ~ 240kDa ville være meget udfordrende, ved hjælp af andre strukturbiologi teknikker såsom røntgenkrystallografi, NMR og Cryo-EM mikroskopi.
Afdække protein struktur via røntgenkrystallografi eller NMR er en iboende tidskrævende proces. Denne flaskehals i struktur bestemmelse er et område hvor SAXSA viser sin styrke som en strukturel teknik; dataopsamling for en enkelt SAXSA eksperiment kan tage mindre end en time og med hjælp af strømlinede analyse software analyse kan ske hurtigt og effektivt. SAXSA har potentiale til høj grad øge gennemløb af strukturelle undersøgelser som en stand-alone teknik, fordi det giver en lav opløsning model af den makromolekylære struktur, før data med høj opløsning er tilgængelige. En barriere for andre strukturelle teknikker er kravet om en meget ren, koncentreret prøve for dataopsamling, hvilket nødvendiggør en høj grad af protein udtryk og stabilitet over en lang periode. Mens SAXSA prøver også behovet for at være ren og koncentreret, prøve diskenheder er omtrent 100 µL gør SAXSA en relativt billig analysemetode i forhold til andre strukturelle teknikker. Derudover bliver SAXSA kombineret med størrelse udstødelse kromatografi mere og mere almindelige som giver en ekstra kvalitetskontrol trin. For nylig har der været stærk fremskridt i kombination af NMR og SAXSA data ved hjælp af Ensemble optimering metode (EOM)45,46 for at belyse fleksible systemer. I et nyligt papir af Mertens og Svergun47beskriver forfatterne flere nylige eksempler på EOM SAXSA i kombination med NMR, sammen med mange andre eksempler på SAXSA data bliver brugt i forbindelse med NMR. Forskud foretages løbende inden for SAXSA, og nye teknikker er ved at blive udviklet til SAXSA at bruges sammen med, ikke bare gratis til andre strukturelle teknikker. Vi mener derfor, at efterspørgslen efter SAXSA kun vil stige over tid, især i forbindelse med NMR at karakterisere dynamiske systemer hvor funktioner er defineret af fleksibilitet.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har været støttet af NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002 C) og Alberta Prion Research Institute / Alberta innoverer Bio Solutions (201600018) tilskud til M.O. TRP er en Canada forskning stol i RNA & Protein Biofysik (201704) og anerkender NSERC opdagelse grant (RGPIN-2017-04003). TM er finansieret af NSERC opdagelse tilskud til TRP.
HEK 293 EBNA Cell Line | In-Lab availability | – | Cell line used to overexpress protein(s) |
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin | GE Healthcare | 17524801 | Affinity protein purification resin |
Superdex 200 Increase 10/300 | GE Healthcare | 28990944 | SEC Column |
ÄKTA Pure FPLC | GE Healthcare | – | FPLC System |
Nanodrop | Nanodrop | – | Spectrophotometer |
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.) | |||
S-MAX3000 | Rigaku | – | SAXS Pinhole Camera System |
Zetasizer Nano-S | Malvern Instruments Ltd | – | Dynamic Light Scattering instrument |
0.1µm Filter | Millipore | JVWP04700 | Used to Concentrate Sample Prior to DLS |
Thrombin cleavage kit | abcam | ab207000 | Thrombin cleavage to remove His tag |
Strep-Tactin Sepharose Column | IBA | 2-1201-010 | Strep-Tag Affinity Purification |
D-desthiobiotin | Sigma-Aldrich | 533-48-2 | Elution of Strep Tag Protein |
Software | |||
SAXGUI | Rigaku | – | Data Collection for SAXS and data reduction |
ATSAS Suit | Franke et al., 2017 | – | SAXS Data Analysis Software program suite |
PRIMUS | Konarev et al., 2003 | – | Buffer Subtraction |
GNOM | Svergun, 1992 | – | Rg, Dmax and p(r) Calculation |
DAMMIF | Franke and Svergun, 2009 | – | Ab initio model calculation |
DAMAVER | Volkov and Svergun, 2003 | – | Averaged Solution Conformation calculations |
MONSA | Svergun, 1999 | – | Simultaneous model fitting for the complex |
GASBOR | Svergun et al., 2001 | – | Alternative Ab initio model calculations |
DTS Software V6.20 | Malvern Instruments Ltd | – | DLS supplied instrument software |
PyMOL | Schrodinger, LLC. | – | The PyMOL Molecular Graphics System V2.0 |
The Protein Data Bank | Berman et al., 2000 | – | PDB ID: 1NPE |