Planta de crescimento e transformação de Floral-mergulho mediada por Agrobacterium do Extremophyte Schrenkiella parvula

Guannan Wang; Pramod Pantha; Kieu-Nga Tran; Dong-Ha Oh; Maheshi Dassanayake

doi:10.3791/58544

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Artigo de método

Planta de crescimento e transformação de Floral-mergulho mediada por Agrobacterium do Extremophyte Schrenkiella parvula

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DOI:

10.3791/58544

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7 de janeiro de 2019

Guannan Wang¹ , Pramod Pantha¹ , Kieu-Nga Tran¹ , Dong-Ha Oh¹ , Maheshi Dassanayake¹

¹Department of Biological Sciences, Louisiana State University

Neste artigo

Resumo

Transformação mediada por Agrobacterium, usando um método de imersão floral pode ser empregada com sucesso para criar linhas transgênicas estáveis do modelo extremophyte Schrenkiella parvula. Apresentamos um protocolo modificado do que para a Arabidopsis thaliana, considerando o crescimento de diferentes hábitos e características fisiológicas do extremophyte.

Resumo

Schrenkiella parvula é uma extremophyte adaptada a vários estresses abióticos, incluindo várias tensões de toxicidade do íon. Apesar da alta qualidade genômicos recursos disponíveis estudar como as plantas se adaptam ao meio ambiente salienta, seu valor como um modelo de genômica funcional e ferramenta tem sido limitada pela falta de um sistema de transformação praticável. Neste protocolo, relatamos como gerar transgénicos estável S. parvula linhas usando um método de imersão floral mediada por Agrobacterium. Nós modificamos o protocolo de transformação utilizado para a. thaliana para contabilizar características únicas de S. parvula, como um hábito de florescimento indeterminado e um teor de ceras epicuticulares alta nas folhas. Brevemente, S. parvula sementes foram estratificadas em 4 ° C por cinco dias antes do plantio. As plantas foram cultivadas em um fotoperíodo de uma luz de 14 h e 10 h escuro e uma 130 µmol m^-2s^-1 intensidade luminosa, a 22 ° C a 24 ° C. Oito a nove semanas plantas com várias inflorescências foram selecionados para a transformação. Estas inflorescências foram mergulhadas em uma solução de infiltração de Agrobacterium tumefaciens GV3101 carregando o plasmídeo pMP90RK . Foram realizadas duas rodadas de flor mergulhando com um intervalo de três a quatro semanas para aumentar a eficiência de transformação. As sementes de T1 foram coletadas e secas por quatro semanas em um recipiente com dessecantes antes de germinação a tela para o candidato transformado linhas. Resistência à BASTA foi usada para plantas T1 de tela. Atingimos a solução BASTA três vezes com um intervalo de três dias, começando com duas semanas de plantas para reduzir falsos positivos. Um teste de gota BASTA foi realizado em sobreviver plantas individuais para identificar o verdadeiro transformants positivo. A eficiência de transformação foi 0.033%, rendendo 3 – 4 plantas transgénicas por 10.000 sementes de T1 propagadas.

Introdução

Neste protocolo, descrevemos o crescimento e a criação de linhas transgênicas estáveis para o modelo extremophyte Schrenkiella parvula. A disponibilidade de um sistema eficiente de transformação é uma marca registrada de qualquer modelo genético versátil. Plantas que prosperam em ambientes extremos, referido como extremophytes, fornecem um recurso crítico para compreender as adaptações de plantas a estresses ambientais. Schrenkiella parvula (anteriormente Thellungiella parvula e Eutrema parvulum) é um tal modelo de extremophyte, com a expansão de recursos genômicos¹^,²^,<....