Eine Reinigung und In vitro- Aktivität Assay für ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium difficile
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Reinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase Enzyme und Dünnschichtchromatographie radioaktiv Substrate und Produkte, für die enzymatische Aktivität in Vitroassay nutzen. Die Enzym-Aktivität-Assay ist breit anwendbar auf Kinase, Nukleotid-Cyclase oder Phosphor-Transfer-Reaktion, deren Mechanismus Nukleotid Triphosphat Hydrolyse umfasst.
Abstract
Kinase und Pyrophosphokinase Enzyme übertragen die Gamma-Phosphat oder Beta-Gamma Pyrophosphat glyko-aus Nukleotid Triphosphat Vorstufen auf Substrate phosphorylierten Produkte zu schaffen. Die Verwendung von γ –32– P bezeichnet NTP Vorstufen ermöglicht die gleichzeitige Überwachung der Substrat-Auslastung und Produkt-Bildung durch Röntgen. Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Zellulose Platten ermöglicht schnelle Trennung und sensible Quantifizierung von Substrat und Produkt. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Nutzung der Dünnschichtchromatographie um die Pyrophosphokinase Aktivität einer gereinigten (p) PpGpp Synthestase assay. Diese Methode wurde zuvor verwendet, um die Aktivität der zyklische Nukleotid und Dinucleotide Synthetasen charakterisieren und eignet sich im großen und ganzen für die Charakterisierung der Aktivität jedes Enzym, das eine Nukleotid Triphosphat Bindung hydrolysiert oder überträgt einen terminal Phosphat von einem Phosphat-Spender zu einem anderen Molekül.
Introduction
Kinase und Pyrophosphokinase (oder Diphospho-Kinase) Enzyme ins Substrat Moleküle Phosphate aus Nukleotid Triphosphat (NTP) Vorstufen. Die Substrate können andere Nukleotide, Aminosäuren oder Proteine, Kohlenhydrate und Lipide1gehören. Bioinformatische Analysen können manchmal ein Enzym cognate Substrat oder Substrate aufgrund der Ähnlichkeit zu gekennzeichnet Enzyme, aber experimenteller Validierung ist immer noch notwendig. Ebenso müssen die Affinität des Enzyms für ihre Substrate und die Rate, mit der es die Phosphor-Transfer Reaktion katalysiert, und die Auswirkungen der Co-Faktoren, Inhibitoren oder anderen Enzym Effektoren experimentell ermittelt werden. Zur Vermeidung von Erschöpfung der ATP-Vorstufe durch andere Enzyme ATP verbrauchenden in bakteriellen Zytoplasma erfordern quantitative Aktivität Assays gereinigtes Protein.
Proteinreinigung durch Metall Affinitätschromatographie wurde gründlich in die Literatur2,3berichtet. Histidin-Tags bestehend aus sechs aufeinander folgende Histidin Rückstände angehängt, N – oder C-Terminus eines rekombinanten Proteins erlauben schnelle Reinigung von Metall Affinität Chromatographie4,5,6. Diese Sequenzen sind klein im Vergleich zu den Proteinen, die Sie ändern und haben in der Regel einen minimalen Einfluss auf die Proteinfunktion, obwohl sie manchmal Proteinstabilität und/oder Enzym Kinetik7,8zu ändern. Histidin-Tags auf die N – und C-Termini des gleichen Proteins können unterschiedliche Auswirkungen haben schwer vorherzusagen, ohne zu wissen, die Struktur des Proteins in Frage stellen. Histidin-Tags sind in der Regel beim Klonen eines rekombinanten Proteins durch die Gestaltung von Grundierungen, die sechs Histidin Rückstände entweder sofort kodieren 3′, die ATG-Start-Codon oder sofort 5′ auf das Stopp-Codon der offenen Leserahmen eingearbeitet. Nach Verstärkung ist das Hexahistidine-haltigen gen in einen Vektor unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors ligiert und zum Ausdruck gebracht, in der Regel in einem Laborstamm von E. Coli. Die Rekombination Protein kann dann auf eine Affinität Harz mit immobilisierten zweiwertigen kationen (in der Regel Nickel oder Kobalt)9isoliert werden. Kontaminierende native Metall-bindende Proteine kann durch Titration mit Imidazol, entfernt werden die gebundenen Protein2kompetitiv verdrängt. Zu guter Letzt ist das Zielprotein aus der Spalte mit höheren Konzentrationen von Imidazol eluiert. Gibt es mehrere kommerzielle Quellen immobilisierten Metall kation Harze, und die Hersteller geben Empfehlungen für die Pufferbedingungen und Imidazol-Konzentrationen. Nach der Elution kann Protein von Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, dialysiert oder sofort in funktionellen Tests verwendet.
Es gibt mehrere Methoden, um die Kinase-Aktivität durch die Kopplung von ATP-Phosphat-Bindung-Hydrolyse zu einer zweiten Reaktion, die veröffentlicht oder reizt ein Fluorophor oder Chemilumineszenz erzeugt mittelbar zu überwachen, aber diese Reaktionen haben mehrere bewegliche Teile und kann logistisch anspruchsvollen10. Der direkteste Weg, insbesondere Phosphor-Transfer Aktivität zu messen ist, direkt die Übertragung von einem radioaktiven Phosphatgruppe von einem handelsüblichen γ –32-P überwachen NTP Vorstufe zu einem Substrat nicht radioaktiv-11 , 12 , 13. Mischungen von radioaktiven Substrate und Produkte getrennt und durch Dünnschichtchromatographie (TLC) quantifiziert werden können. TLC nutzt die differenzielle Mobilität von gelösten Stoffen in einem bestimmten Lösungsmittel dadurch, dass das Lösungsmittel (flüssige Phase) durch Kapillarwirkung über eine Oberfläche (feste Phase) migrieren, auf denen eine Mischung aus gelösten Stoffen adsorbierten14gewesen ist. Solute, die klein sind und/oder günstige Wechselwirkungen mit der festen Phase fehlt migrieren Entfernungen von ihrem ursprünglichen Speicherort als gelöste Stoffe mit höherer Molekulargewichte oder große Affinitäten für die solide. Für die Prüfung der Phosphor-Transfer erhöhen Phosphat Moieties das Molekulargewicht von Molekülen, die sie hinzugefügt werden, die und fügen Sie negativen Ionischen Ladung bei neutralen oder sauren pH11,12,14. Dies verringert ihre Mobilität auf einer Grundfläche wie PEI-Zellulose. Bei der Entwicklung im sauren Kalium-Phosphat-Puffer können Mischungen von Mono – di-, Tri-, Tetra- und Pentaphosphate Arten leicht auf PEI-Zellulose, so dass die Quantifizierung der einzelnen Arten (Abbildung 2, Abbildung 3) getrennt werden. Solche Tests können mit Zelle Lysates, enthält das Enzym von Interesse durchgeführt werden, aber dies beinhaltet das Potential für die Tätigkeit der anderen Kinasen und Phosphatasen allgemeine ATPasen, Substrat und/oder Produkt zum Abbau. Für eine quantitative in-vitro- Bewertung der Enzym-Aktivität ist es notwendig, das Enzym von Interesse zu reinigen.
Guanosin Tetraphosphate (PpGpp) und Guanosin Pentaphosphate (PppGpp) sind Ribonukleotidreduktase Signalisierung Moleküle gebildet durch die Übertragung von einem Pyrophosphat Gruppe aus einem Vorläufer von Adenosintriphosphat (ATP), bzw. ein Guanosin-diphosphat (BIP) oder Guanosin Tetraphosphate (GTP) Substrat15. Diese einzelnen Ribonukleotidreduktase Signale, zusammen bekannt als (p) PpGpp, vermitteln eine Zelle-weite Reaktion auf Umweltstress, bekannt als die strenge Reaktion in unterschiedlichen Bakterienarten15,16. Konservierte Zweiklassen-Enzyme katalysieren die Bildung von (p) PpGpp15,17 Rel/Spo Homolog (RSH) Enzyme sind “lang” bifunktionelle (p) PpGpp Synthestase/Hydrolasen benannt nach ihrer Ähnlichkeit zu den RelA und SpoT (p) PpGpp metabolische Enzyme aus Escherichia coli enthalten Synthestase, Hydrolase und regulatorischen Domains, während kleine Alarmone Synthestase (SAS) Enzyme kurze monofunktionalen Synthetasen fand ausschließlich in Gram-positiven Bakterien-15, sind 17 , 18. das Spore-bildenden Gram-positiven Bakterium Clostridium Difficile kodiert vermeintliche RSH und SAS Gene19. Hier präsentieren wir Ihnen erste Aktivität-Assays, die bestätigen, dass die C. Difficile RSH Enzym ist eine katalytisch aktiven (p) PpGpp Synthestase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier berichten wir die Reinigung des His-Tags RSH von C. Difficile und stellen eine Methode zur Quantifizierung der Aktivität mit radioaktiven Dünnschichtchromatographie. Diese Methode wurde zuvor verwendet, um die Aktivität der Diguanylate Cyclase Enzyme von C. Difficile, sowie (p) PpGpp Synthestase, Nukleotid-Cyclase, Kinase und Phosphodiesterase Enzyme aus anderen Organismen11,12 bewerten ,13,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIAID 1K22AI118929-01 finanziert. EBP wurde unterstützt durch einen Sommer Research Fellowship Programm Zuschuss von der Office of Research bei Old Dominion University in Norfolk, Virginia, USA.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
Referências
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