在这里, 我们提出了字符串组装 grna 克隆 (stagar), 一种方法, 可以很容易地将 grna 载体的 crispr/cas9 方法。st简便, star 使 grna 多路复用变得简单、高效且可定制。
细菌 crispr/cas9 系统大大增加了生命科学家的方法选择。由于其利用, 基因和基因组工程开始适用于大量的系统。此外, 许多转录和表观基因组工程方法现在一般是第一次可行。crispr 具有广泛适用性的一个原因在于它的双边性质。小的 grna 决定了复合物的基因组靶点、蛋白质 cas9 的变种以及局部分子的后果。然而, 许多 crispr 方法依赖于同时将多个 grna 传递到单个细胞中。在这里, 我们提出了一个可自定义的协议字符串组装 grna 克隆 (stasar), 这种方法允许在一个克隆步骤中简单、快速和高效地生成多路复用 grna 表达载体。stegr 具有成本效益, 因为 (在本协议中) 单个靶向序列是通过短悬垂引物引入的, 而 grna 表达盒的长 dna 模板可以重复使用多次。此外, st款允许单步合并大量的 grna, 以及不同 grna 变异、载体和启动子的组合。
字符串组合 grna 克隆 (stasar) 是一种方法, 能够在一个克隆步骤中有效地在一夜生成包含多个 grna 表达盒的表达载体。stasar 协议不依赖于专业知识或材料, 并提供多种定制选项。
细菌 crispr 蛋白 cas9 具有独特的能力。它能够找到并选择性地结合那些 dna 序列编码在自然发生的 crrna 或工程 grna1。它作为分子工具的利用使大量的方法成为不可能的、不可行的或仅限于某些细胞模型, 直到最近。其中包括靶向基因突变2、基因组工程3、表观基因组编辑4、5、6、转录激活和基因沉默7, 8.据我们所知, crispr 是普遍可部署的, 因为它的应用报告存在于广泛的目标地点、细胞类型和物种中。然而, crispr 的许多应用直接或间接地取决于多个 grna 的交付, 包括一系列基因组操作 (转移 9,10, 中11和大规模基因组改变12,13), 基因组工程 (使用 cas9 镍 14,生成条件等位基因 11,15或序列突变 16)和跟踪策略17。此外, 对于其他方法 (转录工程18, 表观基因组工程 19,20), 多个靶向点并不是严格意义上的强制性, 但它们往往只有在这一情况下才能达到最大效果条件。
一些有用的方法已经被描述产生 grna 载体包含一个以上的 grna 表达盒21,22,23, 24,25,26, 27岁在这里, 我们提出了一个协议 stasar, 字符串组装 grna 克隆, 这是突出的组合简单和速度 (只需要一个隔夜克隆步骤), 低成本 (因为 dna 模板可以重复使用多次), 可定制性 (不同的 grna 系统和启动子) 和有效性 (它允许产生含有大量 grna 盒的载体)28。
stagr 原则上可以用来生成表达向量, 其中包括少量 (1-2 grna)、几个 (3-5 grna) 和一些迄今报告的最多的表达式盒式磁带 (6-8 grna)28。同样, star 适用于任何 grna 序列、主干或启动子。然而, 由于 stogr 主要基于聚合酶链反应 (pcr) 和 gibson 组装, 因此应使用另一种方法生成序列相似度较高的 grna。
在这里, 我们提出了一个详细的协议 stasar 允许快速和简单地生成不同大小的 grna 表达质粒。该协议可用于一步生成 grna 质粒与 2-8 grna 表达盒 (有或不与两个 7sK rna 适配体) 到 grna 表达载体 stgr _ neo, 并使用人 u6, 小鼠 u6, 人7sk 和人 h1启动子28,32,33。如果需要四个以上的盒式磁带, 建议至少使用两种不同的启动器类型, 以提高效率。其他载体、启动子和启动子组合以及8个以上的 grna 盒也可能是可行的;然而, 这还没有经过测试。尽管根据我们的经验, 该方法工作可靠且可重复, 但如果预期结果不会立即发生, 我们已经确定了关键步骤和故障排除策略。在我们的经验中, 一些步骤对于该方法的成功至关重要: 首先, 在 gibson 装配步骤 (3:1) 上, 使用正确的刀片与矢量主干的摩尔比是非常重要的。然而, 我们注意到, 对于一些 grna 设置一个1:1 的比例插入到矢量是有益的, 即使 grna 盒数确实超过2。其次, 吉布森组装反应的周期应该足够长 (建议至少 45分钟)。
st款可以通过大量的修改来使用。目标序列、grna 编号和支架、启动子和载体主干可以定制和自由组合。但是, 每个组合可能有稍有不同的要求。根据我们的经验, 如果需要中等或较高数量的 grna 盒式磁带 (和 gt;4), 但没有立即获得, 通常克服这一问题的最快方法是改变单个 grna 盒式磁带在载体中的顺序。同样, 当克隆许多 grna 盒时, 结合不同的 grna 启动子和支架可以提高效率 (从而降低必须打分的菌落 pcr 的数量)。我们发现, 不正确的克隆通常是由吉布森组装过程中重复序列的自发结合产生的。虽然这可以降低该方法的效率, 但这也导致同时生成具有功能 grna 子集的向量 28。
据报道, 生成含有多个 grna 表达盒的多路复用 grna 载体有许多不同的方法21,22,23,24,25, 26,27。虽然有些人采用同时或连续克隆 grna对 22,34, 其他依赖于金门组装和几个顺序克隆步骤25,35。谢等人采用了一种特殊的方法, 利用内源性细胞 trna 处理系统从单个祖先成绩单36中切割出几个 grna。该方法的优点是只需要一个启动子;缺点是每个 grna 组合都需要新合成的 dna 片段。每种 grna 复用方法都有优点和缺点;stadr 结合了简单和高效, 大量可能的 grna 盒式磁带, 成本较低。
stegar (和其他多路复用系统) 很可能有助于在体内有效 (同时) 破坏多个基因,就像斑马鱼大脑28中首创的那样。grna 多路复用载体的另一个未来应用是承诺操纵完整的转录程序, 而不是单个基因的诱导或抑制。很有可能, 这些方法将使细胞和器官随意转化的程度远远高于今天。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢 stephan beck 教授和 jovica ninkovic 教授在开发 stasar 方法方面的投入、帮助和支持。tobias klötzer、anna Klötzer 和 valentin baumann 提供有用的评论。这项工作得到了 dfg (str 1385/1) 的支持。
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |