بروتوكول للسابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية مفيدة للجرح شفاء الدراسات هو وصف. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتقييم آثار عوامل لتعزيز الشفاء التجدد أو سمية العقاقير في بيئة متعددة الخلايا 3D منظم.
القرنية وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة التئام الجروح. القدرة على توليد واستخدام خلايا الثدييات الأولية في اثنين الأبعاد (2D) والثقافة (ثلاثي الأبعاد) الأبعاد الثلاثة قد ولدت ثروة معلومات ليس فقط حول البيولوجيا القرنية ولكن أيضا حول الجرح تضميد الجراح، والبيولوجيا أرومية، وتندب بشكل عام . وهدف البروتوكول هو نظام مقايسة للتحديد الكمي للتنمية أرومية، الذي يميز تندب. علينا أن نظهر ثقافة جهاز القرنية السابقين فيفو نموذج باستخدام عيون خنزير. في هذا كيراتيكتومي الأمامي الجرح، جرح القرنيات لا يزال في أنحاء العالم مع شفرة دائرية تسمى ترفين. يتم إزالة المكونات من حوالي 1/3 للقرنية الأمامي منها الظهارة والغشاء الطابق السفلي والجزء الأمامي ستروما. بعد إصابة، هي القرنيات قص من أنحاء العالم والتي شنت على قاعدة الكولاجين/أجار ومثقف لمدة أسبوعين في المصل تستكمل المتوسطة الحرة مع استقرار فيتامين C لزيادة تكاثر الخلايا وإفراز المصفوفة خارج الخلية من الخلايا الليفية المقيم. تفعيل ميوفيبروبلاستس في ستروما الأمامي يتجلى في القرنية تلتئم. يمكن استخدام هذا النموذج للاعتداء إغلاق الجرح، وضع علامات تليفية وميوفيبروبلاستس، ودراسات علم السموم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار تأثيرات مثبطات جزيء صغير، فضلا عن تعداء siRNA الدهن بوساطة للجينات ضربة قاضية في هذا النظام.
تندب في القرنية الناتجة عن الإصابة أو الصدمة أو الإصابة يمكن أن تؤدي إلى إضعاف نسبة تظليل وفقدان الرؤية الدائمة. ومن ثم، هناك حاجة ماسة لتحديد المسارات التي يمكن أن تكون مستهدفة للتدخل العلاجي. خيارات العلاج الحالية محدودة، وتتمثل أساسا في عمليات زرع القرنية، التي لا يمكن الوصول إلى المرضى عبر العالم. الإنسان (الشكل 1) والقرنية الحيوانية يمكن أن تستخدم ل 2D وخلية 3D ثقافة الدراسات1،2. يمكن الحصول على القرنيات الجثث البشرية لا تصلح لزرع من المصارف العين أو مصارف مركزية الأنسجة (الوطنية المرض بحوث التبادل (ندري))، ويمكن الحصول على عيون الحيوان من مسلخ. الابتدائي الخلايا الظهارية القرنية والليفية stromal وأكثر في الآونة الأخيرة، خلايا بطانية، يمكن عزل ومثقف من هذه الأنسجة لالتئام الجروح ودراسات علم السموم3،،من45. بالإضافة إلى أهمية فهم الأساس الجزيئي لأمراض العيون المسببة للعمى، جعلت إمكانية الحصول على القدرة على الثقافة الابتدائية الخلايا والأنسجة القرنية نظام نموذجا هاما للدراسة. القرنية مثالية لاختبار آثار وكلاء على تندب القرنية عادية تتسم بالشفافية وإنشاء أنواع معينة من الجروح نسبة تظليل أو ندبات تليفية (استعرض في6). في فيفو القرنية الجرح الشفاء نماذج عديدة أيضا على نطاق واسع استخدمت تندب الدراسات1. وقد استخدمت أقل السابقين فيفو القرنية الجرح الشفاء النموذجي7،8 هي تصف بالتفصيل هنا. والهدف من هذا الأسلوب لقياس نتائج تندب تتميز بصانعي تليفية في 3D متعددة الخلايا القرنية السابقين فيفو نموذج النظام.
إصابة الظهارة القرنية التي لا يخل الغشاء الظهارية عادة يغلق داخل 24-72 ح9. قريبا بعد إصابة، تبدأ الخلايا عند حافة ظهارة تنتشر وتهاجر إلى السطح الحر الظهارية، وإعادة تأسيس وظيفة الحاجز الظهارية. هذا النشاط تسلسلياً يليه تفعيل انتشار الخلايا القاعدية القرنية أولاً، وفي مرحلة لاحقة، من الخلايا السليفة التي تقع في منطقة حوفي الخارجي لتحقيق الانتعاش من الخلايا الظهارية الشامل10،11. غالباً ما تشفي هذه الجروح بدون تندب. ومع ذلك، النتائج جرح التي تخترق الغشاء الطابق السفلي ستروما غالباً ما في تشكيل ندبة1. بعد إصابة stromal القرنية، يتم ملؤها سدى مع خلايا أصول متعددة بما في ذلك الخلايا اللحمية المقيم المتباينة، فضلا عن المشتقة من نخاع العظم فيبروسيتيس12،،من1314. ندبات تليفية تتسم باستمرار ميوفيبروبلاستس في التئام الجروح. إظهار هذه ميوفيبروبلاستس المرضية الالتصاق المتزايد من خلال تراكم إينتيجرينس في الالتصاقات المحورية، وألياف الإجهاد أكتين (α-SMA) الهوس α-السلس العضلات والتنشيط المحلي للمصفوفة خارج الخلية (ECM)-المحتبسة الكامنة تحويل عامل النمو-بيتا (TGFβ). التفريق بين الخلايا الظهارية المشتقة، تعرف باسم الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT)، قد يسهم أيضا في ندبة تشكيل6.
هناك توازن دقيق بين الخلية التمايز والمبرمج بعد إصابة. بسبب الخرق في غشاء الطابق السفلي، عوامل النمو مثل عامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF) و TGFβ من الدموع وظهاره يستحم ستروما، الذي يحفز التمايز أرومية، حلقة متواصلة autocrine TGFβ التنشيط، إفراز غير منظم تليفية ECM15،16. ويعزز استمرار ميوفيبروبلاستس في الجرح تلتئم الضباب والندوب في القرنية (الشكل 2). ومع ذلك، في ريجينيراتيفيلي تلتئم الجرح على الرغم من أن تطوير ميوفيبروبلاستس، أنهم أبوبتوسي وهكذا هي غائبة أو انخفاض ملحوظ في عدد في الأنسجة تلتئم في المرجع6،10(استعراض). وهكذا، قد ركزت البحوث على ندبات تليفية جزئيا على الأقل على استهداف الجزيئات التي تحول دون التنمية أرومية المفرط أو أرومية استمرار17،18. نظراً لاستمرار أرومية يميز المرض ندبات وتليفيه على حد سواء في جميع الأنسجة19، قد يكون من المفيد كنظام نموذجي لدراسة الآليات الخلوية العامة التليف القرنية.
في النظام النموذجي، هو إصابة القرنية بشفرة أسطواني يسمى ترفين في حين لا يزال في أنحاء العالم. البشرية ويمكن إصابة الخنازير القرنيات مع أما 6 أو 7 ملم تريفيني؛ للقرنيات الأرنب ترفين 6 مم المفضل. القرنية الخنزير مشابه في الحجم للقرنية البشرية. لأنها فعالة من حيث التكلفة ومتاحة بسهولة في إعداد كبيرة، والقرنيات خنزير تستخدم بشكل روتيني لثقافة الجهاز. وعلاوة على ذلك، قد دأبت كروسريكتيد الأجسام المضادة وسيرناس لتتفاعل مع الإنسان مع خنزير7. بعد إصابة، القرنيات هي قطع من أنحاء العالم مع ليمبوس سليمة والتي شنت على قاعدة أجار/الكولاجين. القرنيات تربى في وسائل الإعلام الحرة المصل بالإضافة إلى استقرت فيتامين (ج) لمحاكاة انتشار تنتجها الخلايا الليفية وإدارة المحتوى في المؤسسة ترسب20. إضافة المصل لا عوامل النمو لا بد للحث على تشكيل أرومية7. القرنيات بشكل روتيني ثابت وتجهيزها للأنسجة بعد أسبوعين ثقافة. للجينات ضربة قاضية، أو لاختبار آثار وكيلاً على التئام الجرح يمكن أن تعامل مع siRNA في الجرح بعد إصابة7 أو عامل القابلة لذوبان يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام، على التوالي8.
ويصف هذا البروتوكول نموذج لدراسة التئام الجروح في بيئة ثلاثية الأبعاد طبقية طبيعية. استخدام جهاز الثقافة كوسيط بين الخلية والثقافة والدراسات المجراة في يقلل كثيرا من التكاليف، فضلا عن الحد من الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الحية. 3D نماذج أخرى قد تم فائدة كبيرة في الميدان بما في ذلك ذاتية …
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمها EY024942 R01 نيي المعاهد الوطنية للصحة، البحوث “منع العمى”، شمال ولاية الطبية جامعة غير المقيد أموال البحث، ومنطقة الليونز 20-يوسف مجهرية وتحليل الصور من مقاطع البارافين أجريت في “صميم مجهرية” و إعداد شرائح نسيجية أنجز في بيوريبوسيتوري وعلم الأمراض الأساسية في “مدرسة الطب آيكان” في جبل سيناء.
PBS | Gibco | 10-010-023 | |
Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
Small scissor | Fisher | 895110 | |
Forceps | Fisher | 08953-F | |
Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
Lipofectamine 2000 | |||
Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
DAPI | Invitrogen | P36931 | |
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera |