Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Summary

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Abstract

Het hoornvlies is gebruikt uitgebreid als een modelsysteem om te studeren wondgenezing. De mogelijkheid om te produceren en gebruiken van primaire cellen van zoogdieren in twee dimensionale (2D) en drie dimensionale (3D) cultuur heeft geleid tot een schat aan informatie niet alleen over hoornvlies biologie, maar ook over de wond genezing, myofibroblast biologie, en littekens in het algemeen . Het doel van het protocol is een assay-systeem voor het kwantificeren van de ontwikkeling van de myofibroblast, die kenmerkend is voor littekens. We tonen een hoornvlies orgel cultuur ex vivo model met behulp van varken ogen. In deze voorste keratectomy wond, zijn cornea’s nog steeds in de hele wereld gewond met een cirkelvormige mes genaamd een trephine. Een stekker van ongeveer 1/3 van het anterieure hoornvlies wordt verwijderd met inbegrip van het epitheel, de kelder-membraan en het voorste deel van het stroma. Na verwonding, hoornvlies gesneden uit de hele wereld, gemonteerd op basis van de collageen/agar en gekweekte voor twee weken in de gratis medium aangevuld-serum met gestabiliseerde vitamine C uitbreiden van celproliferatie en afscheiding van de extracellulaire matrix door fibroblasten resident. Activering van myofibroblasts in het anterieure stroma is duidelijk in het hoornvlies genezen. Dit model kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van wond sluiting, de ontwikkeling van myofibroblasts en fibrotische markeringen, en toxicologische studies. Daarnaast kunnen de effecten van klein molecuul remmers evenals lipide-gemedieerde siRNA transfectie voor gene knockdown worden getest in dit systeem.

Introduction

Littekens in het hoornvlies als gevolg van letsel, trauma of infectie kan leiden tot slopende opaciteit en permanente visie verlies. Er is dus dringend behoefte om te identificeren van de trajecten die voor therapeutische interventie kunnen worden gericht. Huidige behandelingsopties zijn beperkt en bestaat voornamelijk uit het hoornvlies transplantaties, die niet toegankelijk voor patiënten over de hele wereld zijn. Zowel de mens (Figuur 1) en de dierlijke hoornvlies kunnen worden gebruikt voor 2D en 3D-celkweek studies^1,2. Menselijke cadaver hoornvlies niet geschikt is voor transplantatie kunnen worden verkregen van eye banken of gecentraliseerd weefselbanken (nationale ziekte onderzoek Interchange (NDRI)), en dierlijke ogen kunnen worden verkregen in een abattoir. Primaire hoornvlies epitheliale cellen, stromale fibroblasten en meer recentelijk, endotheliale cellen, kunnen worden geïsoleerd en gekweekt uit deze weefsels voor wondgenezing en toxicologische studies^3,4,5. Naast het belang van inzicht in de moleculaire basis van verblindende oogziekte, heeft de toegankelijkheid van weefsel en de mogelijkheid om cultuur primaire cellen gemaakt het hoornvlies een belangrijk model-systeem voor studie. Het hoornvlies is ideaal voor het testen van de effecten van agenten op littekens als het normale hoornvlies transparant is en bepaalde soorten wonden maken opaciteit of fibrotische littekens (herzien in⁶). Verschillende in vivo hoornvlies wond genezing modellen hebben ook uitgebreid gebruikt voor studies¹littekens. Minder gebruikt is geweest de ex vivo hoornvlies wond genezing model^7,8 die in detail hier is beschrijven. Het doel van deze methode is te kwantificeren littekens resultaten gekenmerkt door fibrotische beleidsmakers in een 3D meercellige hoornvlies ex vivo modelsysteem.

Hoornvlies epitheliale verwonding die geen inbreuk op de epitheliale kelder membraan normaal vormt sluit binnen 24-72 h⁹. Kort na de verwonding beginnen de cellen aan de rand van het epithelium verspreiden en migreren naar de epitheliale vrije oppervlakte, te herstellen van epitheliale barrièrefunctie. Deze activiteit wordt opeenvolgend gevolgd door activering van hoornvlies basale celproliferatie, ten eerste en in een later stadium, van voorlopercellen attractiepark van de buitenste limbal zone tot herstel van de epitheliale cellen massa^10,11. Deze wonden genezen vaak zonder littekens. Een wond die het membraan van de kelder in het stroma vaak doordringt resulteert echter in litteken vorming¹. Na het hoornvlies stromale verwonden, is het stroma gevuld met cellen van verschillende oorsprong, met inbegrip van gedifferentieerde resident stromale cellen, alsmede het beenmerg-afgeleide fibrocytes^12,13,14. Fibrotische littekens wordt gekenmerkt door de persistentie van myofibroblasts in een genezende wond. Deze pathologische myofibroblasts tonen verhoogde hechting door de accumulatie van verschijnsel in focal verklevingen, contractiele α-smooth actine (α-SMA) stress spiervezels en lokaal activeren van extracellulaire matrix (ECM)-afgezonderd latente-transformeren groeifactor-beta (TGFβ). De differentiatie van epitheliale-afgeleide cellen, bekend als epitheliale mesenchymale overgang (EMT), kan ook bijdragen tot litteken vorming⁶.

Er is een delicaat evenwicht tussen celdifferentiatie en apoptosis na verwonding. Wegens de breuk in het membraan van de kelder, groeifactoren zoals bloedplaatjes afkomstige groei factor (PDGF) en TGFβ van tranen en het epithelium baden de stroma, inducerende myofibroblast differentiatie, een lus van de duurzame autocrine van TGFβ de activering, en de secretie van ongeorganiseerd fibrotische ECM^15,16. De persistentie van de myofibroblasts in de genezen wond bevordert haze en littekens in het hoornvlies (Figuur 2). Echter, in regeneratively genezen wond hoewel myofibroblasts ontwikkelen, ze neutrophil en aldus zijn afwezig of aanzienlijk verminderd in aantal in het genezen weefsel (herzien in verwijzing^6,10). Zo heeft onderzoek focuste fibrotische littekens op zijn minst gedeeltelijk zich op gericht op moleculen die voorkomen buitensporige myofibroblast ontwikkeling of myofibroblast persistentie^{17,18 dat}. Omdat myofibroblast persistentie zowel littekens en fibrotische ziekte in alle weefsels^{19 kenmerkt}, kan het hoornvlies zinvol zijn als een modelsysteem om te studeren van algemene cellulaire mechanismen van fibrose.

In ons modelsysteem, wordt het hoornvlies verwond met een cilindrische mes genaamd een trephine terwijl nog steeds in de hele wereld. Mens en varken hoornvlies kunnen worden verwond met beide een 6 of 7 mm trephine; voor konijn hoornvlies heeft een 6 mm trephine de voorkeur. Het varken hoornvlies is gelijkaardig in grootte aan het menselijke hoornvlies. Omdat ze kosteneffectief en beschikbaar in grote aantallen zijn, worden varken hoornvlies routinematig gebruikt voor orgel cultuur. Bovendien hebben antilichamen en siRNAs gemaakt om te reageren met mens consequent cross-reacted met varken⁷. Na de verwonding, hoornvlies worden gesneden uit de hele wereld met de limbus intact en gemonteerd op een agar/collageen basis. Het hoornvlies zijn gekweekt in serumvrij media plus gestabiliseerde vitamine C ter simulering van de fibroblast proliferatie en ECM afzetting²⁰. De toevoeging van serum noch groeifactoren zijn nodig voor het opwekken van de myofibroblast formatie⁷. Hoornvlies worden routinematig vast en verwerkt voor histologie na twee weken van cultuur. Voor gen knockdown of voor het testen van de effecten van een agent op de wondgenezing, de wond kan worden behandeld met siRNA in de wond na verwonding⁷ of een oplosbare agent kan worden toegevoegd aan de media, respectievelijk⁸.

Protocol

1. orgel cultuur Voorbereidingen Bereid agar-oplossing als volgt. In een kleine kolf, bereiden 1% agar en 1 mg/mL boviene collageen in DMEM-F12 tot 20 mL. Breng aan de kook op een verwarmingsplaat. Zet de oplossing in een conische buis van 50 mL. Plaats de buis in een waterbad op een hete plaat om te voorkomen dat de oplossing stollen. Bereiden aangevuld serumvrij media (SSFM) volgens de samenstelling die in de Tabel van materialen.Opmerking:</…

Representative Results

Immunohistochemistry is de primaire assay gebruikt voor het analyseren van het succes van de ex vivo wond genezing experiment. Figuur 4 toont de epitheel en anterieure stroma in controle weefsel (figuur 4A, 4B). Zes uur na de verwonding, was het epithelium afwezig (figuur 4C, 4 D). Zes dagen na de verwonding, zoals verwacht, had het epithelium regrown (<strong class=…

Discussion

Dit protocol beschrijft een model voor het bestuderen van de wondgenezing in een natuurlijke gestratificeerd 3D-omgeving. Gebruik van orgel cultuur als een intermediair tussen de celcultuur en in vivo onderzoek reduceert kosten alsmede vermindering procedures op levende dieren. Andere 3D-modellen hebben van groot nut zijn voor het veld inclusief zelf de synthese van collageen gels gemaakt van primaire menselijke hoornvlies fibroblasten² of deze dezelfde cellen ingebed in gels gemaakt van dierlijke…

Materials

PBS	Gibco	10-010-023
Pen Strep	MP Biomedicals	91670049
Bovine Collagen Solution	Advance Biomatrix	5005
Pig eyes with lids attached	Pel-freeze, Arkansas	N/A
6.0 mm trephine	Katena	K28014
Surgical Blade	Personna	0.009
Small scissor	Fisher	895110
Forceps	Fisher	08953-F
Kim Wipes	Kimberly-Clark™ 34120	06-666
60 mm cell culture dishes	Falcon	08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM)			Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C.
DMEM/F-12	Gibco	11330
ITS Liquid Media Supplement	Sigma	I3146	100X
RPMI 1640 Vitamins Solution	Sigma	R7256	100X
Glutathione	Sigma	G6013	Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution	Gibco	25030-081	100X
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140	100X
MEM Sodium pyruvate solution	Gibco	11360	1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM	Sigma	A7292	100X
Gentamicin	Sigma	30-005-CR	200X
Vitamin C	Wako	070-0483	2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine	Fisher Chemical	SI86-1
Tissue Path Cassettes	Fisher	22-272416
Normal Goat Serum (NGS)	Jackson Immuno Research	005-000-121	We use 3% NGS
Mounting Media	Thermo Scientific	TA-030-FM
Safe Clear	Fisher	314-629
Ethyl Alcohol	Ultra Pure	200CSGP	200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%)
Sodium citrate	Fisher	BP327	10mM, pH 6.4
Hematoxylin	EMD Millipore	M10742500
Bluing agent	Ricca Chemical Company	220-106
1% Triton X-100	Fisher	9002-93-1	Diluted in PBS
0.1% Tween 20	Fisher	BP337	Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide	Fisher	H324
DAB Kit	Vector Laboratories	SK-4100
Agar	Fisher	BP1423-500	Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm	Bermis	13-374-12
Moist Chamber			Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent	Qiagen	76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit	Thermo Scientific	12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody	Sigma	F6140	1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody	Sigma	A2547 or C6198 (cy3 conjugated)	1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor	Thermo Scientific	TA-030-FM
DAPI	Invitrogen	P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Scientific	PA1-85999	1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3	Jackson Immuno Research	115-165-146	1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
Zeiss Axioplan2	Zeiss		Microscope
SPOT-2	Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan		CCD camera