成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入
Summary
小動物に効率的なアデノ随伴ウイルス配信しているし、中央に伝達効率を予測するスコアリング システムを確立するウイルス ソリューションで 1% リドカイン塩酸塩を使用して直接髄腔内注入法を紹介します。リドカインによる一時的な弱さの程度によると神経系。
Abstract
アデノ随伴ウイルス (AAV) の髄腔内 (IT) 注入は、中枢神経系中枢神経系遺伝子治療の安全、非侵襲性、優れた伝達効果のおかげでかなりの関心を集めています。前の調査は管理で、それによって神経変性疾患における AAV 配信遺伝子療法の治療の有効性を実証しています。ただし、高率で小動物の IT 管理の技術的な制限により予期しない失敗が報告されています。ここでは、我々 は注射液に 1% リドカイン塩酸塩を加えることによって小動物での腰椎穿刺の成功の程度を示す得点システムを確立しました。さらに注入過渡の弱さの程度が AAV の伝達効率を予測できることを示します。したがって、この IT 注入法は、中枢神経系の幅広い領域を苦しめる中枢神経系疾患のマウスモデルでの治療試験を最適化するために使用できます。
Introduction
AAV はいくつかの副作用と中枢神経系の情報伝達における長期的かつ広範な遺伝子発現を仲介することができます、したがって筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、ハンチントンを含む中枢神経系疾患を治療する遺伝子治療のための最も有望な車の 1 つになりました病気 (HD)、アルツハイマー病 (AD)、ライソゾーム病 (LSD)、ゴーシェ病 (GD)、神経セロイドリポフスチン症 (NCL)1。現在、100 以上の AAV の血清型は人間や動物から分離されています。これらのうち、少なくとも 12 は、臨床で使用されている、最もよくを含む臨床試験使用遺伝子ベクターなど AAV1、2、4、5、6、8、9、rAAVrh.8、および rAAVrh.101,2,3,4、 5,6。
中枢神経系のさまざまな病気は、様々 な中枢神経系の影響を受ける地域や細胞の種類により異なる AAV 配信戦略を必要とします。中枢神経系領域およびセル AAV が変換できる型は血清型によって異なります配信方法だけでなく。たとえば、rAAVrh10 は、ニューロンとグリア細胞髄腔内注入4,7で配信されたときそれが導入に対し、主に全身の静脈内投与 (IV)、配信時はアストロ サイトを変換する示されています。実質内注入は、注射部位の近くにローカル伝達の結果さらに、広範な中枢神経系伝達8 結果として脳から脳脊髄液 (CSF) 注入またはくも膜下腔内注射に対し.研究も示している神経変性疾患における AAV 配信遺伝子療法の治療上の効力によって管理9,10,11。ALS など中枢神経系の広範な領域に影響する疾患、全身配信メソッド4,10と比較して、低い線量と病気に悩まされ、ほとんどの区域をカバーする CSF への髄腔内注入を示されています。最近の研究では、その腰椎穿刺は、ALS は、椎弓切除術、髄腔内カテーテル4に関連付けられている潜在的な傷害を避けるためのマウスモデルの AAV を注入する使用ことができますが示されています。
実験直接腰椎穿刺は、配信エージェント、特に麻酔薬、鎮痛および 188512,13の麻酔で、脊髄に初めて使われました。本報告では、腰椎穿刺、評価してインジェクションの品質を監視する注入剤でアミド由来のローカルの麻酔 1% リドカイン塩酸塩の助けを借りて成体マウスの IT 注入法を示しています。成功した注射は、失敗した注射がこの現象を示さなかったに対しリドカインによる一時的なまひ状態によって示されました。注入効率を予測する 5 つの等級の 1 つとして一時的な弱さのレベルを分類しました。最後に、麻痺の等級によって rAAVrh10 伝達レベルを予測できることを示す.したがって、このくも膜下腔の AAV の配信方法は、中枢神経系疾患の治療実験 AAV を介した遺伝子導入を強化する使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
技術的には、目を覚ましマウスにおける IT 注入中にいくつかの重要な手順があります。まず、適切な操作全体を通じてマウスのジェスチャーと事務所のコントロールが正しく配信されるための前提条件。第二に、最も困難な点はない抵抗せずにあまりにも深く挿入または動物が負傷または針の先端を曲げの場合強い抵抗の下で強制的に挿入する必要がある、針の先端と椎間腔を感じです。第…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、河北省の人材開発省と社会保障 (CY201605) からの助成金と河北省 (H2017206101) の自然科学財団からの助成金によって賄われていたし、広平 Gao の AAV をいただいた先生にはとても感謝しております本研究では。
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
Referências
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