Direct Injection intrathécale de Recombinant Adeno-associated virus chez la souris adulte
Summary
Nous présentons une technique d’injection intrathécale directe à l’aide de chlorhydrate de lidocaïne 1 % dans une solution virale pour assurer une prestation efficace virus adeno-associé à de petits animaux et de mettre en place un système de notation pour prédire l’efficacité de la transduction du central système nerveux selon le degré de faiblesse transitoire induit par la lidocaïne.
Abstract
L’injection intrathécale (IT) d’adeno-associated virus (AAV) a attiré un intérêt considérable pour la thérapie génique CNS en raison de son innocuité, invasif et transduction excellente efficacité dans le système nerveux central. Études antérieures ont démontré la puissance thérapeutique de la thérapie de gène AAV-livrés dans les troubles neurodégénératifs qu’elle administration. Cependant, des taux élevés d’échec imprévisible en raison de la limitation technique d’administration informatique chez de petits animaux ont été signalés. Ici, nous avons mis en place un système de notation pour indiquer la mesure du succès d’une ponction lombaire chez de petits animaux en ajoutant du chlorhydrate de lidocaïne 1 % dans la solution injectable. Plus loin, nous montrons que l’étendue de la faiblesse passagère après une injection peut prédire l’efficacité de la transduction du VAA. Ainsi, cette méthode d’injection TI peut servir à optimiser des essais thérapeutiques dans des modèles murins de maladies de CNS qui touchent de larges régions du SNC.
Introduction
AAV peut médier l’expression génique à long terme et très répandue dans la transduction de CNS avec peu d’effets secondaires et par conséquent est devenu l’un des véhicules plus prometteuses pour la thérapie génique traiter les maladies CNS, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA), Huntington maladie (HD), la maladie d’Alzheimer (ma), maladies lysosomales (LSD), maladie de Gaucher (GD) et céroïde lipofuscinose neuronale (NCL)1. Actuellement, plus de 100 sérotypes d’AAV ont été isolés chez l’homme et les animaux. Parmi ceux-ci, au moins 12 ont été utilisés dans précliniques et des essais cliniques, y compris le plus couramment utilisé des vecteurs de gènes tels que AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 et rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Différentes maladies de CNS nécessitent des stratégies de prestation AAV différentes en raison des diverses régions touchées de CNS et types de cellules. Les régions de la CNS et la cellule types d’AAV peut transduce varie selon le sérotype ainsi que de la méthode de livraison. Par exemple, rAAVrh10 s’est avéré transduce principalement astrocytes par systémique intraveineuse (IV), considérant qu’elle transduites les neurones et cellules gliales par intrathécale injection4,7. En outre, injection de parenchyme a entraîné transduction locale à proximité du site d’injection, tandis que l’injection dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) à travers intraventriculaire ou injection intrathécale a entraîné dans la transduction généralisée du CNS8 . Études ont également démontré l’activité thérapeutique de la thérapie de gène AAV-livrés dans les troubles neurodégénératifs qu’elle administration9,10,11. Les maladies qui affectent les grands domaines du SNC tels que de l’ALS, une injection intrathécale dans le CSF a été démontrée pour couvrir la plupart des régions qui sont affligées par la maladie avec une dose plus faible, par rapport à une délivrance systémique méthode4,10. Des études récentes ont également montré qu’une ponction lombaire peut être utilisée pour injecter AAV dans des modèles murins de la SLA, ce qui évite les risques de blessures associées à une laminectomie et intrathécale cathétérisme4.
Une ponction lombaire expérimentale directe a été utilisée pour livrer des agents, notamment des anesthésiques, à la moelle épinière pour analgésie et anesthésie en 188512,13. Dans ce rapport, Nous illustrons la ponction lombaire méthode d’injection IT chez la souris adulte, avec l’aide de chlorhydrate de lidocaïne 1 %, un anesthésique local amide dérivé, dans la solution injectable pour évaluer et surveiller la qualité de l’injection. Injections réussies ont été marquées par la paralysie transitoire induite par la lidocaïne, tandis que l’échec des injections ne montrent pas ce comportement. Nous avons classé le niveau de faiblesse passagère comme l’un des cinq grades afin de prédire l’efficacité de l’injection. Enfin, nous montrons que le niveau de la transduction de rAAVrh10 peut être prédite par le degré de paralysie. Par conséquent, cette méthode de livraison AAV intrathécale peut servir à AAV-mediated gene-prestation pour thérapie expérimentale des maladies de la CNS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Techniquement, il y a plusieurs étapes critiques pendant l’injection de TI chez les souris éveillés. Tout d’abord, le bon geste et la firme contrôle des souris tout au long de l’opération entière est une condition préalable à la mise en œuvre réussie. Deuxièmement, le point le plus difficile se sent l’espace intervertébral avec la pointe de l’aiguille, car il ne faut pas insérer trop profondément sans résistance ou insérer de force sous une forte résistance dans le cas de blesser les animaux ou…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par une subvention du HEBEI Provincial ministère des ressources humaines et de la sécurité sociale (CY201605) et une subvention de la Fondation sciences naturelles de la Province de Hebei (H2017206101), et nous sommes très reconnaissants à m. Guangping Gao, qui a fourni l’AAV pour cette étude.
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
Referências
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