Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine direkte intrathekale Injektionstechnik mit 1 % Lidocain Hydrochlorid in eine virale Lösung gewährleisten effizienten Adeno-assoziierten Viren Lieferung an Kleintieren und etablieren ein scoring-System zur Vorhersage der Transduktion Effizienz im zentralen Nervensystem nach dem Grad der vorübergehende Schwäche durch Lidocain induziert.
Abstract
Intrathekale (IT) Injektion von Adeno-assoziierte Virus (AAV) hat großes Interesse in der CNS Gentherapie aufgrund seiner Sicherheit, Noninvasiveness und ausgezeichnete Transduktion Wirksamkeit im ZNS gezogen. Frühere Studien zeigten die therapeutische Wirksamkeit der AAV geliefert Gentherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen dadurch Verwaltung. Jedoch wurden hohe Raten von unvorhersehbaren Ausfall aufgrund der technischen Begrenzung der IT-Administration bei kleinen Tieren berichtet. Hier haben wir ein scoring-System um den Erfolg der Lumbalpunktion bei Kleintieren, inwieweit durch Zugabe von 1 % Lidocain Hydrochlorid in der Injektionslösung. Wir zeigen weiter, dass das Ausmaß der vorübergehende Schwäche nach der Injektion die Transduktion Effizienz der AAV vorhersagen kann. So kann dieser IT-Injektionsverfahren zur Therapiestudien in Mausmodellen der ZNS-Erkrankungen zu optimieren, die weite Bereiche des ZNS zu bedrängen.
Introduction
AAV kann vermitteln langfristige und weit verbreitete Genexpression in der CNS-Transduktion mit wenigen Nebenwirkungen und daher eines der vielversprechendsten Fahrzeuge für Gen-Therapie zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Huntington es geworden Krankheit (HK), Alzheimer-Krankheit (AD), lysosomale Speicherkrankheiten (LSD), Gaucher-Krankheit (GD) und neuronale Ceroid Lipofuscinosis (NCL)1. Derzeit sind mehr als 100 AAV Serotypen von Mensch und Tier isoliert gewesen. Unter diesen sind mindestens 12 dienten in präklinischen und klinischen Studien, darunter die am häufigsten verwendeten gen Vektoren wie AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 und rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Andere ZNS-Erkrankungen erfordern unterschiedliche AAV Lieferung Strategien aufgrund der verschiedenen betroffenen CNS Regionen und Zelltypen. Die CNS Regionen und Zelle Arten, die AAV transduzieren kann variiert je nach der Serotyp sowie Versandart. Z. B. rAAVrh10 nachweislich überwiegend transduzieren Astrozyten im Auslieferungszustand durch systemische intravenöse Injektion (IV), während es Neuronen und Glia im Auslieferungszustand durch intrathekale Injektion4,7ausgestrahlt. Darüber hinaus führte Parenchym Injektion in lokalen Transduktion bis in die Nähe der Injektionsstelle, während Injektion in den Liquor cerebrospinalis (CSF) durch intraventrikuläre oder intrathekale Injektion führte zu weit verbreiteten CNS Transduktion8 . Studien haben auch therapeutische Potenz der AAV geliefert Gentherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen dadurch Verwaltung9,10,11gezeigt. Bei Erkrankungen, die weite Bereiche des ZNS wie ALS betreffen, hat sich intrathekale Injektion in den Liquor gezeigt, die meisten Bereiche abzudecken, die durch die Krankheit mit einer niedrigeren Dosis, im Vergleich zu einer systemischen Lieferung Methode4,10befallen sind. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass Lumbalpunktion AAV injizieren in Mausmodellen für ALS, die mögliche Verletzungen verbunden mit Laminektomie und intrathekale Katheterisierung4vermeidet einsetzbar.
Experimentelle direkte Lumbalpunktion wurde zuerst verwendet, das Rückenmark zur Analgesie und Anästhesie in 188512,13Agenten, vor allem Anästhetika, anzubieten. In diesem Bericht zeigen wir die lumbale Punktion IT Injektionsverfahren bei Erwachsenen Mäusen mit Hilfe von 1 % Lidocain Hydrochlorid, einem lokalen Amid abgeleitet Betäubungsmittel in die Injektionslösung zur Bewertung und Überwachung der Qualität der Injektion. Erfolgreiche Injektionen waren geprägt von Lidocain-induzierte vorübergehende Lähmung, während fehlerhafte Injektionen nicht dieses Verhalten zeigen. Wir klassifizieren die Höhe der vorübergehende Schwäche als einer der fünf Klassen, um die Effizienz der Injektion vorherzusagen. Schließlich zeigen wir, dass die rAAVrh10 Transduktion Ebene durch den Grad der Lähmung vorhergesagt werden kann. Daher kann diese intrathekale AAV Lieferung Methode verwendet werden, um AAV-vermittelten gen-Lieferung für experimentelle Therapie von ZNS-Erkrankungen zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Technisch gibt es mehrere wichtige Schritte während der IT-Injektion bei Mäusen wach. Erste, richtige Geste und Firma Kontrolle der Mäuse während der gesamten Operation ist Voraussetzung für die erfolgreiche Zustellung. Zweitens ist der schwierigste Punkt den Bandscheiben Raum mit der Nadelspitze, Gefühl, wie es notwendig, nicht zu tief ohne Widerstand einfügen oder gewaltsam unter starken Widerstand ist bei verletzen die Tiere oder die Nadelspitze biegen einfügen. Drittens, obwohl die vorübergehende Lähmung du…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von HEBEI Provinz Department of Human Resources und soziale Sicherheit (CY201605) und einen Zuschuss von Natural Science Foundation der Provinz Hebei (H2017206101) finanziert, und wir sind sehr dankbar, dass Dr. Guangping Gao, versorgte sie mit AAV für Diese Studie.
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
Referências
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