במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים
Summary
כאן אנו מציגים טכניקה הזרקה ישירה במחלה באמצעות הידרוכלוריד לידוקאין 1% פתרון ויראלי להבטיח משלוח וירוס יעיל adeno-הקשורים לבעלי חיים קטנים ולהקים מערכת הניקוד לחזות התמרה חושית יעילות המרכזי מערכת העצבים על פי מידת חולשה חולפת הנגרמת על ידי לידוקאין.
Abstract
הזרקת במחלה (IT) של adeno-הקשורים וירוס (AAV) יש עניין רב ב- CNS ריפוי גנטי מכוח את הבטיחות, noninvasiveness, והיעילות התמרה חושית מעולה שלופה מערכת העצבים. מחקרים קודמים הדגימו העוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל. עם זאת, שיעור גבוה של כשל לא צפוי עקב המגבלה הטכנית של הממשל זה חיות קטנות דווחו. . הנה, הקמנו מערכת הניקוד כדי לציין את מידת ההצלחה מותני אצל בעלי חיים קטנים על-ידי הוספת 1% לידוקאין הידרוכלוריד בתוך תמיסת הזרקה. בהמשך נראה כי מידת החולשה ארעית לאחר ההזרקה ניתן לחזות את יעילות התמרה חושית AAV. לכן, בשיטה זו זריקה זה יכול לשמש כדי למטב טיפולית ניסויים במודלים של העכבר של מחלות מערכת העצבים המרכזית מעשן יותר אזורים רחב של מערכת העצבים.
Introduction
AAV יכולים לתווך גנים בהעברת CNS עם מעט תופעות לוואי לטווח ארוך ונפוץ, ולכן הפך לאחד הרכבים המבטיחים ביותר עבור ריפוי גנטי לטיפול במחלות CNS כולל נוירודגנרטיביות (ALS), הנטינגטון (HD), מחלת אלצהיימר (AD), באנזימים מחלות (LSD), מחלת Gaucher (GD) מחלות ceroid עצביים lipofuscinosis (NCL)1. כיום, יותר מ-100 AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם היה מבודד של בני האדם ובעלי החיים. בין אלה, לפחות 12 השתמשו בפרה, ניסויים קליניים, כולל הנפוץ ביותר בשימוש ג’ין וקטורים כגון AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ו- rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
מחלות מערכת העצבים המרכזית שונות דורשות אסטרטגיות שונות משלוח AAV עקב אזורים המושפעים CNS סוגי תאים שונים. CNS אזורים של התא סוגי AAV יכול מגלי משתנה בהתאם serotype כמו גם שיטת מסירה. לדוגמה, rAAVrh10 הוכח מגלי בעיקר האסטרוציטים כאשר נמסר על ידי הזרקה תוך ורידי סיסטמי (IV), ואילו זה transduced נוירונים וגם עכשיו, דונלד כאשר נמסר על ידי במחלה הזרקה4,7. בנוסף, הביאו parenchyma הזרקת התמרה חושית מקומיים כדי באזור ההזרקה, ואילו זריקה לתוך הנוזל מוחי שדרתי (CSF) דרך ע או הזרקת במחלה, גרמו CNS נפוצה של התמרה חושית8 . מחקרים גם הראו עוצמה טיפולית של טיפול גנטי המועבר AAV הפרעות ניווניות לפיו המינהל9,10,11. מחלות המשפיעות על אזורים רחבים של מערכת העצבים כגון ALS, במחלה הזרקה לתוך CSF הוכח כדי לכסות את רוב אזורים נגועים על ידי המחלה במינון נמוך, בהשוואה למשלוח מערכתית שיטה4,10. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם שאת המותני ניתן להזריק AAV במודלים של העכבר על ALS, אשר מונע פציעות פוטנציאליות המשויך צנתור laminectomy ולא במחלה4.
ניסיוני מותני ישירה שימש תחילה למסור סוכנים, בייחוד הרדמה, חוט השדרה שיכוך כאבים, הרדמה 188512,13. בדו ח זה, אנו ממחישים הניקוב המותני זה בשיטת הזרקת בעכברים בוגרים בסיועם של 1% לידוקאין הידרוכלוריד, מקומיים אמיד-derived הרדמה, בפתרון הזרקת להעריך, לפקח על איכות הזרקה. זריקות מוצלחות סומנו על ידי לידוקאין-induced שיתוק חולף, בעוד זריקות כושלות לא הראה התנהגות זו. אנו מסווגים את הרמה של חולשה ארעי כאחת חמישה ציונים כדי לעזור לחזות את יעילות הזרקת. לבסוף, אנו מראים כי רמת התמרה חושית rAAVrh10 עשוי להיות שמנבאת את הציון של שיתוק. לכן, שיטת העברה זו במחלה AAV יכול לשמש כדי לשפר את המסירה הגן בתיווך AAV לטיפול ניסיוני של מחלות מערכת העצבים המרכזית.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכנית, ישנם מספר שלבים קריטיים במהלך הזריקה זה בעכברים ער. ראשית, ראוי המחווה ושליטה המשרד של העכברים לאורך כל המבצע הוא תנאי מוקדם מסירה מוצלחת. שנית, הנקודה הכי קשה הוא מרגיש את החלל בין-חולייתי עם קצה המחט, כפי שנדרש לא להוסיף יותר מדי עמוק ללא התנגדות או להוסיף בכפייה תחת התנגדות חריפה ב?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי מענק של חביי המחוז המחלקה של משאבי אנוש, ביטוח לאומי (CY201605), מענק של מדעי הטבע קרן של מחוז הביי (H2017206101), ואנחנו מאוד אסיר תודה ד ר על גאו Guangping, שסיפק את AAV עבור מחקר זה.
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
Referências
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success–a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neurociência. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, 1-10 (2016).
