Direkta intratekal injektion av rekombinant Adeno-associerade virus i vuxna möss
Summary
Här presenterar vi en direkt intratekal injektionsteknik med 1% lidokain hydroklorid i en viral lösning att säkerställa effektiv adeno-associerade virus leverans till små djur och etablera ett scoringsystem för att förutsäga transduktion effektivitet i central nervsystemet enligt graden av övergående svaghet orsakade av lidokain.
Abstract
Intratekal (IT) injektion av adeno-associerade virus (AAV) har dragit betydande intresse i CNS genterapi enligt dess säkerhet, noninvasiveness och utmärkt transduktion effekt i CNS. Tidigare studier har visat terapeutiska styrkan av AAV-levererade genterapi i neurodegenerativa sjukdomar av det administration. Dock har höga andelen oförutsägbara misslyckande på grund av tekniska begränsning av IT-administration i små djur rapporterats. Här, etablerat vi ett poängsystem för att ange framgång omfattningen av lumbalpunktion i små djur genom att lägga 1% lidokain hydroklorid i injektionslösningen. Vi visar vidare att omfattningen av övergående svaghet efter injektion kan förutsäga AAV transduktion effektivitet. Denna IT injektion metod kan således användas för att optimera terapeutiska prövningar i musmodeller av CNS-sjukdomar som drabbar breda regioner av CNS.
Introduction
AAV kan medla långsiktiga och omfattande genuttryck i den CNS transduktion med få biverkningar, och därför har blivit en av de mest lovande fordon för genterapi att behandla CNS sjukdomar inklusive amyotrofisk lateralskleros (ALS), Huntingtons sjukdom (HD), Alzheimers sjukdom (AD), lysosomala lagring sjukdomar (LSD), Gauchers sjukdom (GD) och neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. För närvarande har mer än 100 AAV serotyper isolerats från människor och djur. Bland dessa, minst 12 har använts i prekliniska och kliniska prövningar, inklusive de vanligaste används genen vektorer såsom AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 och rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Olika CNS sjukdomar kräver olika AAV leverans strategier på grund av de olika drabbade CNS regionerna och celltyper. CNS regionerna och cell typer som AAV kan transduce varierar beroende på serotypen samt leveransmetod. RAAVrh10 har till exempel visat sig transduce huvudsakligen astrocyter när levereras av systemisk intravenös injektion (IV), medan det sensorik både nervceller och glia när levereras av intratekal injektion4,7. Dessutom, resulterade parenkymet injektion i lokala transduktion till närheten av injektionsstället, medan injektion i cerebrospinalvätskan (CSF) via intraventrikulär eller intratekal injektion resulterade i omfattande CNS transduktion8 . Studier har också visat terapeutiska styrka av AAV-levererade genterapi i neurodegenerativa sjukdomar av det administration9,10,11. Sjukdomar som påverkar breda områden i CNS som ALS, har intratekal injektion i CSF visat att täcka de flesta områden som är drabbade av sjukdomen med en lägre dos, jämfört med en systemisk leverans metod4,10. Nyligen genomförda studier har också visat att lumbalpunktion kan användas för att injicera AAV i musmodeller för ALS, som undviker potentiella skador associerade med laminektomi och intratekal kateterisering4.
Experimentell direkt lumbalpunktion användes först att leverera ombud, särskilt bedövningsmedel, till ryggmärgen för analgesi och anestesi i 188512,13. I betänkandet illustrera vi den lumbal punktion IT injektion metod i vuxna möss med hjälp av 1% lidokain hydroklorid, en lokal Amid-derived bedövningsmedel, i injektionslösningen att utvärdera och övervaka injektion kvalitet. Framgångsrika injektioner präglades av lidokain-inducerad övergående förlamning, medan misslyckade injektioner inte visade detta beteende. Vi klassificeras nivån på övergående svaghet som en av fem kvaliteter för att förutsäga injektion effektivitet. Slutligen visar vi att rAAVrh10 transduktion nivån kan förutsägas av grad av förlamning. Detta intratekal AAV leveransmetod kan därför användas för att förbättra AAV-medierad gen-leverans för experimentell behandling av CNS-sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tekniskt sett finns det flera kritiska steg under IT injektionen i vaken möss. Första, rätt gest och företaget kontroll av möss under hela operationen är en förutsättning för framgångsrik leverans. Det andra är den svåraste punkten känsla intervertebral utrymme med kanylspetsen, som det är nödvändigt att inte infoga för djupt utan motstånd eller infoga med våld under starkt motstånd när det gäller skadar djuren eller böjning nålspetsen. Tredje, även om den övergående förlamningen på grund av …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av anslaget från HEBEI provinsiella institutionen av mänskliga resurser och Social trygghet (CY201605) och ett bidrag från naturvetenskap Foundation i Hebei-provinsen (H2017206101), och vi är mycket tacksam för Dr Guangping Gao, som tillhandahöll AAV för denna studie.
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
Referências
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success–a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neurociência. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, 1-10 (2016).
