Ett detaljerat protokoll för bedömning av strukturella och visuell avläsning på gnagare av optisk koherens tomografi och optokinetic svar presenteras. Resultaten ger värdefulla insikter för oftalmologiska samt neurologisk forskning.
Optisk koherenstomografi (OCT) är en snabb, icke-invasiv, interferometrisk teknik möjliggör högupplöst retinal imaging. Det är ett idealiskt verktyg för utredning av processerna för neurodegeneration, neuroprotektion och neuro-reparation som involverar det visuella systemet, som dessa ofta korrelerar väl med retinala förändringar. Som en funktionell avläsning används visuellt framkallat kompenserande ögon- och huvudrörelser ofta i experimentella modeller som involverar den visuell funktionen. Kombinera båda tekniker tillåter en kvantitativ invivo utredning av struktur och funktion, som kan användas för att undersöka sjukdomstillstånd eller att utvärdera potentialen för romanen therapeutics. En stor fördel av de presenterade teknikerna är möjligheten att utföra longitudinella analyser vilket gör att utredningen av dynamiska processer, minska variabiliteten och skär ner antalet djur behövs för experiment. Protokollet beskrivs syftar till att ge en handbok för förvärv och analys av hög kvalitet retinal skanningar av möss och råttor med hjälp av en låg kostnad anpassad hållare med möjlighet för att leverera inhalational anestesi. Dessutom, är den föreslagna handboken avsedd som en instruktions manual för forskare som använder optokinetic svar (OKR) analys hos gnagare, som kan anpassas till deras särskilda behov och intressen.
Undersökningen av den visuella vägen, som en del av det centrala nervsystemet, har visat sig vara en effektiv utgångspunkt att ta itu med inte bara oftalmologiska1,2,3,4,5 , men även neurologiska6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,15,16 frågor. Under de senaste åren, OCT och OKR har identifierats som användbara analytisk, icke-invasiva verktyg för att utvärdera ett stort utbud av retinopati och retinal manifestationer i olika djurmodeller17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT möjliggör snabb och hög upplösning i vivo visualisering av näthinnans morfologi och struktur i möss och råttor, med resultat i god överensstämmelse med histologiska sektioner av djur retinae26. OKR utgör en snabb och robust metod för att bedöma kvantitativt visuell funktion.
Många OCT enheter tillåter samtidiga confocal scanning laser Oftalmoskopi (cSLO) imaging med olika våglängder, som ger diagnostisk information om retinal patologier, dvs, visualisering av lipofuscin insättningar eller förändringar av retinal pigment epitel27. Dessutom är i vivo imaging av fluorescens märkta celler i transgena djur möjligt28,29,30,31,32. Dock är tillämpningen av OCT teknik i djurmodeller fortfarande utmanande, främst på grund av den små öga storleken. Flera kommersiellt tillgängliga enheter kräver anpassningar och ofta en annan storlek av innehavaren är skyldig att bild djur av olika arter. Dessutom kräver djur anestesi för mätning.
OKR-enheter kan användas för att bedöma funktionen visuella hos gnagare. Djuren är placerade på en plattform i mitten av en faktisk eller virtuella cylinder visar ett rörligt gallerdurk, som djuren spåra med reflexiva huvud och hals rörelser. Detta optokinetic svar minskas eller elimineras vid minskning eller förlust av visuell funktion.
Syftet med detta protokoll är att presentera en handbok för mätning av retinal tjocklek använder en kommersiellt tillgänglig OCT-enhet med en anpassad hållare som tillhandahåller inhalationsmedel anestesi. Protokollet visar hur att analysera volym skanningar med hjälp av programvara som tillhandahålls av tillverkaren. För visuell provning, är syftet att ge instruktioner om hur du använder en kommersiellt tillgänglig system för att bedöma OKR.
Detta protokoll ger en anvisning för tjocklek mätningar och undersökning av synfunktion hos gnagare. Visuell avläsning används alltmer i translationell forskning18,26,38,39,40 och kan enkelt överföras till kliniska prövningar. Betydande fördelen med OCT jämfört med histologiska undersökningar i djurförsök är att longitudinella analyser är möjliga att låta utredningen av dynamiska patologiska processer, till stor del minska variabiliteten och antalet djur som behövs per studie. I vivo imaging med OCT omfattas dessutom inte av fixering, skärning eller färgning artefakter, som kan påverka lagrartjockleken i histologiska undersökningar.
Ortogonala orientering av laserstrålen i samtliga plan i förhållande till näthinnan är dock ett viktigt steg för att säkerställa kvalitet och reproducerbarhet av tjocklek värden. Det kräver viss utbildning av prövaren och är obligatoriskt innan förvärvet av OCT skanningar. Dessutom som de kommersiella enheterna är utformade för användning på människor, är kvaliteten på gnagare OCT bilder fortfarande sämre jämfört med B-skanningar av mänskliga patienter. I författarnas erfarenhet, kan det vara svårt att skilja de olika inre retinal lager (retinala nerv fiberskiktet, ganglion cellager och inre plexiform lagret) under Manuell korrigering. Vi rekommenderar därför analysera dessa lager som en förening avläsning (IRL).
Den experimentella setup innehåller ett alternativ för flyktiga anestesi, t.ex., inhalationsmedel isofluran, vilket är, enligt vår erfarenhet, säkrare och lättare att kontrollera än injicerbara anestesi, exempelvis ketamin-xylazin41,42 och minskar risken av för tidigt uppvaknande av gnagare vid längre förvärv gånger (t.ex. När du utför avbildning av fluorescently märkta celler). I en preliminär studie identifierades volym skanningar som protokollen med högsta giltighet och tillförlitlighet. Den mellan bedömare och test retest tillförlitligheten var utmärkt när volymen skanningar exklusive den centrala delen som innehåller synnervspapillen bedömdes med ICC (intra-klass korrelationskoefficienten) värden över 0,85 för alla bedömningar.
Mätning av optokinetic svaret är baserat på den ofrivilliga optokinetic reflex, som utförs som respons på ett kontinuerligt flytta fält. Hos gnagare, i motsats till andra arter, innebär rörelsen inte bara ögonen, utan hela huvudet, som enkelt kan upptäckas med hjälp av kameran.
Särskiljande mellan ”tracking” eller normal beteendemässiga förflyttningar av djuren kräver viss utbildning av prövaren och det är viktigt att vara blind för den experimentella gruppen. Dessutom djuren behöver en anpassning fas att rymma till experimentella inställning och under lång tid mätning protokoll, djuren måste vara animerade upprepade gånger för att försäkra att ”ingen tracking” beror på att nå tröskeln OKR och inte till att minska uppmärksamhet. Det finns också en betydande stam variabilitet angående funktionen visuell laboratorium möss och råttor43,44. Synskärpan av gnagare bör därför utvärderas innan de testas och vissa stammar, såsom SJL möss, kanske inte ens är lämplig för OKR mätningar, eftersom de är homozygota för allelen Pde6brd1 (retinal degeneration 1).
Sammanfattningsvis, granskning av näthinnans morfologi och visuell funktion i djurmodeller tillåter icke-invasiv, longitudinella undersökningar av strukturella och funktionella skador som uppkommer i samband med EAE och kan vara till hjälp i andra modeller där visuellt system, inklusive men inte begränsat till modeller av retinopati eller synnerven skada.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag av Dr. Robert Pfleger-stiftelsen och Ilselore Luckow-Foundation, samt Biogen och Novartis till PA. Figur 1B återskapades från ”hela kroppen positionella manipulatorer för okulär imaging bedövat möss och råttor: en gör det själv-guide. Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, Aktas, O., A. U., Brandt, H., Hartung, HP., Green, A., Albrecht, s. BMJ Open oftalmologi. 1 (1), e000008, 2017 ”med tillstånd från BMJ Publishing Group Ltd.
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.10.0 |
blue 25D non-contact lens | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | lens for rodent mesurement |
OptoMotry | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | system for visual function analysis |
OptoMorty HD software | CerebralMechanics Inc., Canada | N/A | Version 2.1.0 |
Inhalation Anesthetic Isoflurane | Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA | 803250 | inhalation anesthetic |
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5% | University Hospital Düsseldorf, Germany | N/A | pupillary dilation |
Visc-Ophtal | Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany | 58407 | ophthalmologic eye gel |
GraphPad Prism | GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software, Version 5.00 |
IBM SPSS Statistics | IBM Corporation, Armonk, New York, USA | N/A | statistical analysis software, Version 20 |