Detta protokoll innehåller nödvändiga steg för att upprätta och utvärdera neonatal sepsis i 7 dagar gamla möss.
Neonatal sepsis är fortfarande en global börda. En preklinisk modell till skärmen effektiva förebyggande eller terapeutiska insatser behövs. Neonatal mus polymikrobiella sepsis kan induceras av injicera cecal flytgödsel intraperitonealt i dag av livet 7 möss och övervaka dem för följande vecka. Här presenteras de detaljerade steg som är nödvändiga för genomförandet av denna neonatal sepsis modell. Detta inkluderar att göra en homogen cecal flytgödsel lager, späda ut den till en vikt – och skräp-justerade dos, en disposition av övervakningsschema, och en definition av observerade hälsa kategorier används för att definiera humana slutpunkter. Generering av en homogen cecal flytgödsel lager från poolade givare tillåter förvaltning till många kullar över tid, att minska variationen mellan givare och förhindrar användning av potentiellt toxiska glycerol. Övervakningsstrategin används möjliggör föregripande av överlevnad utfall och identifiering av möss som senare skulle utvecklas till döds, vilket möjliggör en tidigare identifiering av humana slutpunkten. Två huvudsakliga beteendemässiga egenskaper används för att definiera hälsa poängen, nämligen de neonatala möss förmåga att just själva när den placeras på ryggen och deras nivå av rörlighet. Dessa kriterier skulle potentiellt kunna tillämpas på adress humana slutpunkter i andra studier av neonatal sjukdom hos möss, så länge som en pilot studie utförs för att bekräfta riktigheten. Sammanfattningsvis ger denna metod en standardiserad metod modell nyfödda sepsis hos möss, samtidigt som resurser för att bedöma djurens välbefinnande används för att definiera tidig humana slutpunkter för utmanade djur.
Sepsis är en ledande orsak till nyfödda smittsamma dödsfall1. Eftersom nyfödda sepsis är dåligt känd, har få framsteg gjorts i båda identifiering av at-risk nyfödda tidigt under sjukdomen och utveckling av effektiva behandlingar eller profylax. Detta kräver användning av djurmodeller av sepsis att bättre förstå de process och testa eventuella interventionerna. Dessutom reagerar vuxna gnagare olika på sepsis, med statistiskt signifikanta skillnader i antalet bakterier att administrera för att erhålla samma dödlig dos (LD) och skillnader i den resulterande värd Svaren jämfört med nyfödda2. Neonatal sepsis har således, att studeras hos nyfödda. Flera vuxna sepsis modeller har använts i sepsis forskning. Dessa inkluderar en intravenös utmaning med specifika organismer inblandad i vuxen människa sepsis eller cecal ligering och punktering (CLP). CLP är en endogen utmaning modell där blindtarmen är kirurgiskt isolerade, sammanskrivna och punkteras så att läckage av tarminnehållet i bukhinnan, så småningom leder till systemisk spridning av mikroorganismer och deras produkter3. Men är det kirurgiska ingreppet som krävs för att fastställa CLP dödliga för nyfödda djur; Därför behövs en alternativ metod att efterlikna polymikrobiella utmaningen att CLP att inducera neonatal sepsis. Cecal flytgödsel modellen för neonatal polymikrobiella sepsis utvecklades för att tillgodose det behovet, whereby cecal innehållet i djur skördas, upphängd i sterila glukos 5% i vatten (D5W) och injiceras intraperitonealt i nyfödda möss2. Detta har sedan, blivit en alltmer populär modell att studera sepsis i både nyfödda och vuxna djur och har väsentligen avancerade mekanistiska insikter i sjukdomens process4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Med tanke på den ökande användningen av denna modell och önskan av forskare att direkt jämföra resultaten över publikationer, finns det ett behov för de tekniska aspekterna vara väl beskrivna och standardiserat i studier. Standardisering gäller tre aspekter av modellen, nämligen i) utarbetandet av cecal flytgödsel beståndet, ii) utarbetandet av de utmaning alikvoter för injektion i försöksdjuren, och iii) definitionen av humana slutpunkten whereby djur anses nonsurvivors i utmaning experiment. Specifikt, refereras metoder för att förbereda cecal flytgödsel beståndet ofta till den ursprungliga artikeln att införa den modell2. En kort sammanfattning av denna modell är att cecal innehållet från vuxna möss var skördas, upphängd i sterila D5W till en koncentration på 80 mg/mL, och används inom 2 h för att injicera försöksdjuren. Denna ursprungliga modell används möss i samma ålder, från samma leverantör plats, som var inrymt i deras respektive forskningsanläggningar för mindre än 2 veckor före skörd cecal innehållet. Användningen av interna Förädlat möss, ökat trots att minska kostnaden från vanliga leverantör leverans och möjliggör användning av överskott möss av ett bredare spektrum av kön och ålder, också väsentligt givare-till-givare variabilitet. Detta motiverade utvecklingen av en alternativ teknik, whereby cecal innehållet från flera möss var poolade tillsammans för att förbereda ett stort lager, som då var aliquoted och lagras vid-80 ° C13. Denna alternativa metod har anpassats av flera grupper14,15. Att anpassningen resulterade dock i vissa tekniska variationer, både i de lagringsmedia som används (10% eller 15% glycerol eller D5W ensam) och i strategin för filtrering ta bort partiklar (flerstegs filtrering genom en 860 µm och, sedan, en 190 µm filter eller individ filtreringar genom 100 µm eller 70 µm filter)13,14,15. Injektion av glycerol ensam kan potentiellt skada, med tanke på att 25-50% glycerol injektioner har använts som en gnagare modell av njurskada16,17,18,19, 20. För att undvika oavsiktliga biverkningar av glycerol, cecal flytgödsel lager förberedelserna för möss i denna studie är frysta i D5W utan glycerol, och tester av bakteriell livskraft från lagring vid-80 ° C utförs. Den filtrering strategi som används i denna studie är en passera genom en 70 µm filter, som inte direkt har jämförts med de andra strategier för filtrering som anges.
Dödliga vikt justerade doser injiceras cecal slurry kan variera från anläggning till anläggning och bör titrerade ut till önskad dödlighet för enskilda grupper. Med olika utmaning doser ändra de medföljande utmaning volymerna av nödvändighet. Detta metodologiska uppgifter har dock inte rapporterats före. Dessutom strategier för standardiserade förfaranden, såsom intraperitoneal injektion, är sällan utarbetas på inom litteraturen, men enskilda tekniker kan påverka huruvida nyfödda möss läcka när injiceras och påverka deras slutliga resultat.
Djurskydd, inklusive en definition av Human slutpunkt, är en central aspekt av denna modell och i någon modell av infektion och inflammation i gnagare21. 1998 offentliggjort kanadensiska rådet på Animal Care (CCAC) omfattande riktlinjer för Human slutpunkt urval, definiera humana slutpunkten som ”alla faktiska eller potentiella smärta, ångest eller obehag ska minimeras eller lindras genom att välja de tidigaste slutpunkten som är kompatibel med vetenskapliga målen för forskningen ”22. Andra också försiktighet att humana slutpunkter måste fastställas baserat på vetenskaplig motivering snarare än på en subjektiv tolkning av djurets tillstånd enbart21. Medan det finns en mängd resurser för klinisk, beteendemässiga, och kroppskondition tecken-baserade kriterier för humana slutpunkten, även i samband med infektion och inflammation specifikt21,23,24, ingen av dessa , inklusive CCAC riktlinjerna för humana slutpunkten22, nämna nyfödda möss. Således, objektivt och vetenskapligt motiverade humana slutpunkter är mycket svårare att fastställa för nyfödda djur, både möjligheterna begränsade beteende och bristen på bevis från kriterier som viktminskning, som vanligtvis används för vuxen möss. För närvarande kriterierna för humana slutpunkten används för 5-12 dag-gamla neonatala möss i cecal flytgödsel litteraturen allt referera tillbaka till den original-manuskript som introducerade den modell2. I detta ursprungliga papper baserades definitionen av Human slutpunkt för nyfödda djur på två kriterier. nämligen, platsen för en mus utanför boet (spridning) och bristen på mjölk ställen hade setts att leda till döden inom timmar. En komplicerande fråga i tilldela en human slutpunkt är att mjölk fläckar blir svåra att se i mus stammar med mörk päls, såsom vanligen anställd C57BL/6J stam, efter den första veckan i livet, medan sjuka djur övervakas tills den 14: e dagen i livet (DOL). Ytterligare, döda djur kan hittas postchallenge vid tillämpningen av dessa kriterier (egen observation, opublicerade); Således krävs en strängare definition av humana slutpunkten att lindra lidande försöksdjur och undvika dödlighet i situationer där resultatet kunde noggrant urskiljas tidigare.
Alla tre metodologiska aspekter av cecal flytgödsel modellen presenteras i ett normalförfarande detailing utarbetandet av cecal flytgödsel lager, en metod för att injicera försöksdjur som håller den injektion volym konstanten mellan doserna och minskar risken för läckor, och en definition av humana slutpunkten för 7 – 12 dag-gamla möss baserat på ett system av beteendemässiga modellering. Beteendemässiga information av mus hälsa noter från över 240 experimentella djur samlades in och grupperade efter sista överlevnad utfall, visar en bevis-driven definition av humana slutpunkten. Lidande av försöksdjur minskas genom att identifiera döende neonatala möss den tidigaste möjliga tidpunkt, medan biologiskt signifikanta överlevnad utfall kan härledas genom att observera nyckelvariabler. En visuell representation av både cecal flytgödsel förberedelse och neonatal mus beteenden kommer att fungera som en utmärkt resurs till någon grupp studera sepsis eller nyfödda utmaning modell djur.
Postnatal neonatala möss har mycket begränsad rörlighet och misslyckas att rätta sig efter att ha placerats på ryggen, även när oemotsagda. Av DOL 7, åldern av möss utmanas i denna modell, ett utbud av rörelse som sträcker sig från rättigheter-Mobile till FTR-Mobile observerades i ohotad möss, med en viktig skillnad, nämligen att en ohotad mus vid denna ålder ingen visade FTR-slö beteende. Endast möss utmanas med polymikrobiella sepsis har observerats för att bli FTR-slöa; Detta svar kan därför vara en markör för sjukdomens svårighetsgrad. Att uppmärksamma brytpunkten på 90° vinkel från horisontell för hip rörelse tillåter för konsekventa och korrekta tilldelning av slö eller mobila hip rörelse hos möss. Tidsramen för 4 s för att se om en mus kan rätt själv valdes eftersom ohotad möss kunde konsekvent rätt sig inom denna tidsram. Upprepad mätning av samma mus undveks, medan tiden till höger själva och mätning av höft rörlighet begränsades till 4 s, undvika alltför tröttande musen, som annars kan påverka dess förmåga att få mat och värme och kan påverka dess prognosen att bli bättre. Rätande sig från både vänster och höger sida observerades och den högre av poängen användes för att avgöra om musen var på en human slutpunkt, eftersom vissa möss visade för att Visa FTR-Nonmobile på ena sidan ännu har en högre rörlighet på andra sida och b e kunna återhämta sig så småningom.
Det poängsystem som används till att utvärdera musen hälsan åberopade tillämpningen av kategoriska cutoffs på vad är ett spektrum av rörelse och därför kunde vara benägna att enskilda bias. Personalen utbildades tillsammans att säkerställa varje person gjorde mössen samma; Det kommer dock sannolikt att förbli en nivå av subjektivitet som leder till variation. Konsekvens av scoring utvärderades genom att ha sju forskare som inte hade tidigare utfört neonatal mus övervakning Läs kraven som anges i detta protokoll och video och sedan självständigt tilldela beteenden och bestämma humana slutpunkten. En 97% noggrannhet observerades med scoring utförs på 60 utmanade möss, vilket tyder på att enskilda bias inte spelar en betydande roll i de beteendemässiga uppdrag av denna modell. Presenterade beteendemässiga övervakning protokollet är baserat på observationer av djur utmanas på DOL 7, men möss som är yngre än 6 dagar i en ohotad felfritt tillstånd kan inte konsekvent just själva. Således kunde kriterierna som beskrivs humana slutpunkten inte appliceras direkt på yngre möss. Om yngre möss som används i denna experimentella modell eller om en annorlunda utmaning modell med olika sjukdomen kinetik används, måste sedan lämplig Human slutpunkt kriterier utvecklas och lotsade Undvik dödshjälpen av möss som skulle annars, så småningom, återställa. Poängsystem som visar en robust metod att förbättra humana slutpunkten klassificering som, med provning och bekräftelse, skulle potentiellt kunna tillämpas på andra modeller.
Varje beredning av cecal slam eller användning av en ny mus stam krävs retitration av cecal flytgödsel dosen att administrera för att uppnå en liknande dödlig dos. Varje gång sedan standardiserades av uppläsningen av intresse, nämligen överlevnad, snarare än att ge samma bakterie räkningen. Varje cecal flytgödsel beredningens livskraftig bakteriell koncentration varierade något, eventuellt på grund av skillnader i givarens kommensaler bakterier eller på grund av variationer i vikt kvar i cellen silen av den cecal flytgödsel lager postfiltration. Under titrering av cecal slam, de första två kullarna var indelade i två grupper och varje halva av kullen utmanades med en av de två doserna så att var och en av doserna som skulle testas i två kullar. Om den resulterande överlevnaden inte matchade nivån som krävs, sedan utmaningen dosen var antingen ökat eller minskat med 5% – 10% och experimentet upprepas. Flera kullar har använts för att redogöra för kull-till-kullen skillnader som kunde orsaka resistens eller ökad känslighet för sepsis över en kull. Det var viktigt att korrekt titer cecal flytgödsel beståndet med varje nytt preparat att säkerställa att nya titrering av cecal flytgödsel var jämförbar med föregående cecal flytgödsel preparat. Perioder av överflödigt buller och vibrationer, särskilt under den komprimering av asfalt och byggandet av en närliggande byggnad och road, observerades för att öka stress i dammarna. Detta korrelerade med ökad förekomst av cannibalization, och påverkade dödligheten hos de överlevnad experiment, även påverkar ohotad möss, vilket indikerar att det kan finnas ovidkommande påverkan på neonatal överlevnad som också behöver styras för.
Tidigare metoder för cecal flytgödsel lager förberedelsen ingår antingen användning av färska cecal flytgödsel eller beredning av frysta cecal flytgödsel, med hjälp av olika metoder, inklusive lagring i glycerol som oundvikligen skulle överföras under utmaningen. Även användningen av färska cecal flytgödsel ger fördelen av att ha en bakteriell sammansättning som är närmast original cecal innehållet, finns risken för variansen mellan enskilda givare möss på grund av kommensaler bakterier. Medan detta var minimeras genom att använda cecal givare från samma leverantör med minimal tid mellan ankomst och progression av experimentet, detta kunde bli en kostnad-oöverkomliga alternativ för vissa laboratorier och presenterade en annan timing logistik utmaning att ha åldersmatchade möss tillgängliga när vederbörande inleder en cecal slurry experimentera i neonatala möss som var 7 dagar gamla. En alternativ metod att använda färska cecal flytgödsel utnyttjades, där flera vuxna givarnas cecal innehållet var poolade, resuspended i D5W, fryst vid-80 ° C utan glycerol, och tinade en alikvot i taget för experiment. Utnyttjandet av vuxen donator cecal flytgödsel att studera neonatal sepsis kunde potentiellt överföra arter av bakterier som finns i den cecal flytgödsel som neonatal musen inte har utsatts för, men det är en strategi som möjliggör studier av sepsis hos neonatala möss och har använts för att studera neonatal mus biologi i den tidigare13,14,15. Cecal flytgödsel var utspädd i D5W att ge näring till bakterier, vilket möjliggjorde upprättandet av en aktiv infektion när bakterierna var injiceras, och gjordes för att efterlikna tillgången på näringsämnen i peritoneal hålighet under nekrotiserande enterokolit. Glycerol ingick inte som en stabiliserande agent i frysning bakterier på grund av de potentiella negativa biverkningar som kan uppstå från glycerol injektion ensam. Om glycerol hade inkluderats i cecal flytgödsel beredning, då den potentiella skadan att glycerol ensam kunde framkalla skulle behöver testas för genom att inkludera en glycerol-bara (saknar cecal slurry) injektion i möss, vilket skulle ha ökat mus användning. Bakterier livskraft cecal flytgödsel bestånden testades efter frysning cecal flytgödsel beståndet utan glycerol och befanns vara konstant, med ingen förändring i bakterier koncentration i separata portioner av samma cecal flytgödsel preparatet lagras vid-80 ° C över en 6 månadersperiod. Detta tyder på att lagring utan glycerol är genomförbart att tillhandahålla ett konsekvent biologiska resultat. Användningen av en bulk-beredd frysta cecal flytgödsel lager tillåtet också för användning av möss föds upp internt, minska kostnaden och därför utnyttja hanmöss som annars skulle vara överflödig från avel, minska slöseri med musen.
Identifiering av misslyckade utmaningar hos möss var viktigt att undvika att lägga extra buller till systemet. Efter att ha genomgått en intraperitoneal injektion cecal slurry, observerades möss för förekomsten av en utbuktning under huden, som indikerade en misslyckad injektion som var faktiskt subkutan. Möss observerades efter läckor på injektionsstället, både omedelbart efter nålen borttagning och ger dem möjlighet att ta ett steg efter injektionen, eftersom möss skulle ibland (sällan) läcka bara efter att ha flyttat delgrunden injektionsstället genom att ta ett steg. Förekomsten av en utbuktning eller läcka efter injektionen resulterade i att ta bort musen från analysen. Efter alla, kan endera av dessa leda till en annan utgång på grund av de felaktiga cecal flytgödsel injiceras som en 5% skillnad i utmaning dos har observerats påverka efterföljande överlevnad.
Cecal flytgödsel utmaning experimenterar ofta krävs varierande mål dödliga doser med varierande vikt justerade doser. På grund av detta, kan injektionsvolymer variera från så lite som 20 µL och upp till 100 µL. Den proportionella experimentella fel i samband med döda nål volym ändras också tillsammans med injektionsvolymen, ökar svårigheten för att direkt jämföra olika doser. Med enkel ändring av standardisera injektionsvolymen, tas denna källa av variansen bort från experimentet.
Musens neonatal beteendemässiga övervakningssystem, som används i detta protokoll är först i sitt slag. Forskare avsikt att bedriva etisk forskning med nyfödda möss ställs ofta inför utmanande bristen på resurser att bedöma djurens välbefinnande vid denna ålder. Presenterade intuitivt och konsekvent övervakningssystemet börjar att åtgärda bristen på denna kunskap. Allt detta bevis-driven strategi inte bara ökar kvaliteten på den experimentella data som erhållits men, samtidigt, också minskar lidandet för försöksdjuren.
The authors have nothing to disclose.
Speciellt tack till Claire Harrison och Animal Care anläggningen på British Columbia Children’s Hospital Research Institute (BCCHR) för deras stöd i djurens arbete samt Dr Po-Yan Cheng för deras vägledning och ingång på djur övervakning och välbefinnande.
0.1 – 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
100 – 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
1 – 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
5 mL pipette | Costar | 4487 | |
6 – 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
Scale | Sartorius | BL 150 S | |
Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
Styrofoam board | Any | n.a | |
Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |