Скрининг Хлопковых Генотипов для Сопротивления Нематод Рениформ
Summary
Здесь представлен протокол для быстрого неразрушающего скрининга хлопковых генотипов на рениформную устойчивость нематод. Протокол включает в себя визуальное изучение корней нематод-инфицированных саженцев хлопка для определения реакции инфекции. Вегетативная съемка с каждого растения затем распространяется для восстановления растений для производства семян.
Abstract
Быстрый неразрушающий reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) протокол скрининга необходим для развития резистентного хлопка (Gossypium hirsutum) сортов для улучшения управления нематод. Большинство протоколов включают извлечение нематод вермиформа или яиц из корневой системы хлопка или почвы для заливки для определения плотности населения или скорости воспроизводства. Эти подходы, как правило, отнимают много времени с небольшим количеством оцениваемых генотипов. Здесь описан альтернативный подход, в котором корневая система визуально исследуется на нематодную инфекцию. Протокол включает в себя прививку саженцев хлопка через 7 дней после посадки с вермиформными нематодами и определение количества самок, прикрепленных к корневой системе через 28 дней после прививки. Данные выражаются как количество самок на грамм свежего корневого веса, чтобы приспособиться к изменению роста корней. Протокол предоставляет отличный метод оценки устойчивости хозяина-растения, связанного со способностью нематод установить место заражения; однако, сопротивление, которое препятствует репроизводству нематод не оценивается. Как и в других протоколах скрининга, вариации обычно наблюдаются при нематодной инфекции среди отдельных генотипов внутри и между экспериментами. Данные представлены для иллюстрации диапазона вариаций, наблюдаемых с помощью протокола. Чтобы приспособиться к этому изменению, в эксперименты включены контрольные генотипы. Тем не менее, протокол обеспечивает простой и быстрый метод оценки устойчивости хоста и растений. Протокол успешно используется для выявления устойчивых присоединений от G. сбор зародышевой плазмы и оценка сегрегации популяций более чем 300 особей для определения генетики резистентности. Был также разработан метод вегетативного распространения для восстановления растений для размножения резистентности. После удаления корневой системы для оценки нематод, вегетативная съемка пересаживается, чтобы позволить развитие новой корневой системы. Более 95% побегов обычно развивают новую корневую систему, растения достигают зрелости.
Introduction
Ротиленчулус рениформис (Линфорд и Оливейра), обычно называют reniform нематод, является одним из основных паразитических видов нематод, присутствующих в почвах юго-восточной части Соединенных Штатов1,2,3. Нематод является облик, сидячий полуэндопаразит, требующий принимающей завод для завершения своего жизненного цикла2,4. Vermiform preadult женские нематоды проникают в корневую систему хозяина, чтобы установить место кормления в стеле2,3. Как нематод питается и созревает, задняя часть, оставшаяся за пределами корня хозяина будет набухать на производство яиц, образуя характерную форму почек (Рисунок 1). Rotylenchulus reniformis способен питаться корневой системой более 300 видов растений, в том числе хлопка4. Нагорный хлопок (Gossypium hirsutum L.) широко культивируется на юго-востоке Соединенных Штатов, но отсутствие R. резистентные сорта reniformis препятствуютуправлению нематодом 2,3. Стратегии управления, такие как обработка нематидов и вращение с непринимающими видами сельскохозяйственных культур, были использованы для уменьшения почвы R. reniformis плотность населения5,6, но потери урожайности хлопка семян обычно может варьироваться от 1 до 5%2. Симптомы R. reniformis инфекции может включать задержку роста растений, подавленный рост корней, дефицит питательных веществ, аборт ы плодоовощ, и задержка зрелости2. Тем не менее, симптомы не могут быть очевидными из-за единообразия симптомов по всей области; поэтому подходы к оценке R. reniformis инфекции необходимы для выявления и разработки устойчивых горных сортов хлопка. Оценка R. резистентность reniformis в хлопке считается трудной 7, потому что зараженная корневая система может казаться нормальной, даже если растение может показать симптомы инфекции8.
Эффективный протокол скрининга нематод необходим для идентификации R. reniformis устойчивые присоединения из хлопка зародышевой плазмы коллекции, а также для определения генетики сопротивления для этих присоединений. Такой протокол поможет в передаче генов сопротивления на горн-хлопку. Различные методы биоассажа были использованы для оценки R. reniformis инфекции в хлопке8,9,10,11,12,13,14,15. В целом, для идентификации R. reniformis устойчивых хлопка генотипов. Наиболее часто используемый подход включает в себя извлечение яиц и/иливермиформных нематод из инфицированных растений или почвы 8,11,12,14,15. Общая методология такого подхода включает в себя посадку семян для отдельных генотипов хлопка в отдельных горшках, что позволяет саженцы развиваться в течение 7 до 14 дней, прививки саженцы, добавив смесь vermiform этапов R. reniformis к почве, и позволяет нематод заразить корневую систему в течение 30 до 60 дней. Далее, vermiform нематод и / или яйца извлекаются из зараженной корневой системы каждого растения или из почвы заливки. Затем определяется количество извлеченных нематод или яиц для оценки плотности населения и скорости размножения, которые сравниваются с контрольными генотипами для выявления устойчивых генотипов.
Альтернативный подход, как описано здесь, включает в себя микроскопически изучения корневой системы хлопка, который был инфицирован нематод, чтобы определить количество женщин нематод паразитирующих корни10,16. Как и другие подходы, хлопковые генотипы высаживаются в отдельные горшки и прививаются вермиформными нематодами примерно через 7 дней после посадки. В течение 30 дней после прививки корневая система удаляется из отдельных растений и почва промывается из корней. Далее, нематоды, прикрепленные к корневой системе,окрашены красным пищевым краситель17 , и корни микроскопически рассмотрены, чтобы определить количество инфекции сайтов с устойчивыми генотипами хлопка (определяется на основе количества нематод на грамм корня) по сравнению с восприимчивым контролем16. Преимущество этого второго подхода заключается в увеличении пропускной связи за счет сокращения количества дней, необходимых для оценки, и увеличения числа отдельных генотипов, оцениваемых в рамках одного эксперимента. Методологии скрининга, которые оценивают плотность населения или скорость воспроизводства, часто занимаютбольше времени, чем методы, основанные на визуальных наблюдениях признаков инфекции 7. Однако одним из ограничений этого подхода является то, что устойчивость к растениям, которая препятствует репроизводству нематод, как это определено производством яиц, не оценивается13.
Протоколы скрининга для R. сопротивление reniformis часто разрушают корневую систему во время оценки7 и включают вегетативную съемку, отбрасываемую. Для преодоления этого ограничения был разработан метод вегетативного распространения, позволяющий восстанавливать растения для производства семян18. После удаления корневой системы для оценки нематод, вегетативная съемка посажается в почву заливки, чтобы корневая система вырасти. Этот метод имеет широкие применения для большинства R. протоколы скрининга reniformis. Простой и быстрый метод вегетативного распространения имеет решающее значение для размножения R. reniformis устойчивых горных сортов хлопка, где восстановление потомства требуется для продвижения устойчивых генотипов для следующего поколения.
Представлен протокол для масштабного скрининга хлопковых генотипов на резиформную устойчивость нематод. Цель состоит в том, чтобы разработать простой и быстрый неразрушающий метод скрининга для оценки популяций хлопка для нематодной устойчивости, чтобы помочь в разведении устойчивых сортов хлопка на горней. Используя этот протокол, данные обычно получаются в течение 35 дней, при этом более 300 генотипов оцениваются в одном эксперименте. Данные представлены для устойчивых и восприимчивых генотипов, чтобы проиллюстрировать вариации обычно наблюдаются с помощью этих методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффективный протокол скрининга необходим для 1) идентификации R. reniformis устойчивых хлопковых генотипов для того, чтобы оценить генетику сопротивления и 2) размножения устойчивых сортов. Большинство протоколов оценивают R. reniformis плотность населения или скорость воспро…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов, Службой сельскохозяйственных исследований. Упоминание торговых наименований и коммерческих продуктов в данной статье предназначено исключительно для предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендаций или одобрений Со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем. Авторы не имеют конфликта интересов, чтобы объявить. Техническую помощь оказала Кристи Джордан.
Materials
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
Referências
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R., Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -. P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W., et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
