כאן, אנו מתארים שיטה לטהר מהכלורופלסט ללא פגע מן העלים תודרנית שלהם שלוש הראשי תת התאים (מעטפה, משתית, thylakoids), באמצעות שילוב של centrifugations דיפרנציאלית, מעברי צבע, Percoll רציף, מעברי צבע סוכרוז מקוטע. השיטה היא יקר עבור subplastidial ולוקליזציה subcellular של חלבונים על-ידי immunoblotting פרוטאומיקס.
מהכלורופלסט הם המרכיבים העיקריים של תאי צמחים. Plastids כזה למלא פונקציות מכריע רבות כגון הטמעת פחמן, גופרית, חנקן, כמו גם סינתזה של מטבוליטים חיוני. Organelles אלה מורכבות של הבאים שלושה מפתחות המשנה התאים. המעטפה, המאופיינת על ידי שתי ממברנות המקיף את אברון ושולט על התקשורת של פלסטידה עם תאים תאים אחרים. Stroma הוא השלב מסיסים של כלורופלסט, האתר המרכזי שבו פחמן דו-חמצני מומר פחמימות. קרום תילקואיד היא הרשת קרום פנימי המורכב grana (שקי דחוס שטוח) ומניחים lamellae (מבנים צפופים פחות), בו פוטוסינתזה oxygenic לוקח. בפרוטוקול הנוכחי מתאר צעד אחר צעד הליכים הדרושים עבור הטיהור, באמצעות centrifugations דיפרנציאלית ומעברי Percoll, של מהכלורופלסט שלם מתוך תודרניתולאחר fractionation שלהם, באמצעות מעברי צבע סוכרוז, ב-3 תאים תת (קרי, מעטפה, משתית ו thylakoids). פרוטוקול זה גם מתן הוראות כיצד להעריך את הטוהר של השברים האלה באמצעות סמנים משויך התאים כלורופלסט תת השונים. השיטה המתוארת כאן יקר, עבור subplastidial לוקליזציה של חלבונים באמצעות immunoblotting, אלא גם עבור subcellular ו- subplastidial פרוטאומיקס, מחקרים אחרים.
מהכלורופלסט הם המרכיבים העיקריים של תאי צמחים. הם שואבים אב קדמון cyanobacterial יש מיתוג של endosymbiosis, בסופו של דבר התפתח כמו אברון במהלך האבולוציה1,2. Organelles כאלה מכילים שלושה ראשי מדורים (איור 1). מערכת מעטפה עשויה הפנימית של וממברנות החיצוני המקיף את אברון. מערכת זו קרום כפול מכיל אנזימים שונים המעורבים במטבוליזם של שומנים, פיגמנטים, והוא בעיקר המוקדש השליטה של התקשורת בין plastids את ציטוזול. הוא מכיל מערכות תחבורה שונים המאפשרים היבוא של חלבונים גרעיניים מקודד ולאחר החלפת יונים ו מטבוליטים בין את ציטוזול של כלורופלסט במטרה לווסת פונקציות מטבוליות חיוניות של הצמח תא3,4 . Stroma, השלב מסיסים כלורופלסט, מכיל אנזימים של מחזור קלווין (CO2 התבוללות), הסינתזה של מטבוליטים שונים כולל חומצות אמינו, ויטמינים של machineries תמלול ותרגום של פלסטידה. קרום תילקואיד היא רשת קרום פנימי נרחב מאורגנות שם מתקיים שלב אור של פוטוסינתזה. ובכך, מהכלורופלסט הם המקום שבו מסלולים מטבוליים חיוניים להתרחש5.
כדי לפענח את מנגנוני הרגולציה חדשים הקובעות את הדינמיקה כלורופלסט, פיזיולוגיה, הגדרת לוקליזציה תת-plastidial של כלורופלסט חלבונים ולכן קריטי כדי לתמוך יישוב מחקרים במטרה להבין טוב יותר את פונקציות חלבונים מודל אורגניזמים6. על מנת לקבל גישה לוקליזציה subplastidial מקורית של חלבונים אלה, ולכן חיוני כדי להתחיל שברים subplastidial מאוד טהור (מעטפה ממברנות stroma, thylakoids). בהקשר זה, מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לטהר מהכלורופלסט ללא פגע מן העלים תודרנית שימוש דיפרנציאלי centrifugations ומעברי Percoll רציף, וכדי fractionate אותם באמצעות מעברי צבע סוכרוז מקוטע, ב-3 תאים תת (קרי, מעטפה, משתית ו thylakoids). השיטה המתוארת כאן גם מספק הוראות כדי להעריך את טוהר מטוהרים שברים תת-אבחון באמצעות סמנים משויך התאים כלורופלסט תת השונים. פרוטוקול זה יקר, עבור subplastidial לוקליזציה של חלבונים באמצעות immunoblotting ועבור ניתוח נוסף של שברים מטוהרים באמצעות ספקטרומטר מסה (MS)-המבוסס על מחקרים פרוטיאומיה מבנית.
המאמר הנוכחי שואפת פירוט פרוטוקול צעד אחר צעד שמשמש לטהר מהכלורופלסט (וגם את התאים משנה) של תודרנית לבנה. מאז הזמינות של רצף הגנום המלא שלו כמעט שני עשורים, ואת אוספים גדולים של מוטציות הכניסה לרשות הקהילה, תודרנית עכשיו מקובל כמו צמח מודל. עם זאת, בעוד הצמח הזה היה מותאם בצורה מושלמת עבור גישות גנטיות, צמח המדענים צריך להתאים כלים הביוכימי פיזיולוגיים למודל זה המתעוררים. פרוטוקולים ומאפשר לטהר מהכלורופלסט photosynthetically הפעיל מן העלים ומבוססת הביוכימי דגמים כמו תרד12 או אפונה13 וכך היה צריך להיות מותאם. השיטה הראשונה המתארת טיהור של תודרנית מהכלורופלסט פורסם ב 199814, לפני שחרורו של רצף הגנום תודרנית . מספר שנים מאוחר יותר, פשוט שיטות לבידוד תודרנית מהכלורופלסט התואמים מחקרים במטרה לנתח במבחנה ייבוא של חלבונים ב- organelles מטוהרים נעשו זמינים15,16. עם זאת, שיטות אלה לא איפשרה לשלב בין רמה גבוהה של טוהר ושימור הפעילות פוטוסינתטיים של בתורה מהכלורופלסט מטוהרים. לאחרונה17, שיטה מהירה הוקמה, אשר נסמכת על השימוש של מעברי צבע Percoll, ומאפשר לשמור כמעט 90% של קצב פוטוסינתזה נמדד העלים ההתחלתי של תודרנית.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לטהר תודרנית מהכלורופלסט ברמה מעולה של טוהר. אכן, זיהוי אימונולוגי של מזהמים של תאים תאים אחרים הדגימו כי organelles מטוהרת הם חסרי מיטוכונדריאלי קרום פלזמה סמני9,10. פרוטוקול זה גם היה יעיל לטהר מהכלורופלסט של מספר תודרנית ecotypes18, כמו קולומביה (Col) או Wassilewskija (WS), קרי, ecotypes משמש הגנום או הביע רצף תגיות (ESTs) רצף פרויקטים אבל גם, כדי ליצור ב- T-DNA ההכנסה מוטציות ב תודרנית. במילים אחרות, כאשר מחקרים פרוטאומיקס חייב להתבצע, פרוטוקול הנוכחי הוא תואם ecotypes התייחסות שני אלה של תודרנית. לבסוף, התשואה של מהכלורופלסט משתמש בפרוטוקול הנוכחי הוא דומה לזה המתקבל כאשר החל מעלי תרד או אפונה (קרי, 3%, כפי שנמדד מן התוכן כלורופיל כלורופלסט מטוהר Percoll בהשוואה לסה כלורופיל הסכום הנוכחי החל עלים). במונחים של חלבונים, התשואה קרובה 50 מ”ג של כלורופלסט חלבונים, כאשר organelles וגופם מטוהר מ 500 גרם של בת שבוע 5 תודרנית עלים.
כדי להגיע כזה של תשואה טובה (ותקינות כלורופלסט), אחד עם זאת צריך לשים לב מיוחד במספר שלבים בעת שימוש בפרוטוקול הנוכחי. כלורופלסט ב תודרנית הוא מבנה רגישים במיוחד (זהו לא המקרה מהכלורופלסט אפונה, לדוגמה). תשומת לב מסוימת ולכן נדרשת כדי למנוע קרע בקנה מידה גדול של organelles במהלך טיהור. המספר והגודל של גרגרי עמילן נוכח מהכלורופלסט הם קריטיים עבור הכנת מהכלורופלסט ללא פגע. אכן, מהכלורופלסט המכיל עמילן גדול תבואה בדרך כלל יהיה שבור במהלך השלבים centrifugations מבדלת הראשונית שמטרתה להתרכז כלורופלסט גולמי שברים12. לכן, הצמחים יש לשמור לילה בחדר חשוך וקר (4 ° C) לפני הניסוי, כדי להפחית את כמות עמילן.
משתמשים חדשים של הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מפתה כדי להתחיל כמויות גדולות יותר של החומר העלה (ענק רוזטות מצמחים תודרנית הישן עם עלים גדולים) מנסה לשפר את ההתאוששות של מהכלורופלסט מטוהרים. עם זאת, בידיים שלנו, החל מעלים צעירים (5-בת שבוע) הוא הפשרה הטובה ביותר לשלב בין התשואה, טוהר, שלמות organelles מטוהרים. אכן, עלים זקנים מדי מאוד מועשרים תרכובות בעל תאים פנוליים כי הוצגו יש השפעה שלילית על תקינות כלורופלסט19.
לבסוף, השלב הראשוני החילוץ (שחיקה של הרקמה) היא עוד צעד קריטי. תהליך המיזוג חייב להיות מוגבל כמה שניות. כאמור לעיל, משתמשים חדשים עלול להתפתות להשתמש מיזוג יותר, ובכך מצפה מאוד לשפר את התשואה של organelles מטוהרים. עם זאת, אם המיזוג יותר ביעילות משחרר עוד חומר של עלים, נראה כי שיעור מהכלורופלסט שבור במהירות מגביר תמצית תא גולמי. בשל זה יחס גבוה של שבור כדי מהכלורופלסט שלם בטווח הבינוני, עוד צעדים טיהור (ההפרדה על מעברי צבע Percoll) בחום מושפע, התשואה של הטיהור הוא נמוך באופן בלתי צפוי.
הזמינות של פרוטוקולים ספציפיים לטהר organelles אפשרו סדרה של תפוקה גבוהה מבוסס פרוטאומיקס ניסויים להתנהל על דגימות כלורופלסט. נתונים אלה נעשו זמינים ב מספר מסדי נתונים ציבוריים6, ובכך לספק ביולוגים בשדה לוקליזציה subcellular (וגם subplastidial) מדויק של חלבונים כלורופלסט רבים. זה היה נכון במיוחד עבור המעטפה חלבונים אשר זהותו, מיקום נותרה בעיקר ידוע לפני ניתוחים אלה, מאז המעטפה ממברנות מהוות רכיב כלורופלסט מינור (1-2% מכלל החלבונים כלורופלסט) בעת ששיחק תפקיד מפתח כלורופלסט חילוף החומרים, להן5,20. באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, ניתחנו לאחרונה את ההרכב של התאים העיקריים כלורופלסט שלושה מן תודרנית (קרי, stroma, את thylakoids, ועל מערכת קרום מעטפה)9. בהתבסס על גישה פרוטאומיקס הכמותיים למחצה (ספירת ספקטרלי), היינו יכולים להעריך חלוקת מאות חלבונים בקרונות כלורופלסט שלושה אלה.
בעוד בפרוטוקול הנוכחי מאפשר לטהר את שלושה תאי העיקרי כלורופלסט מ תודרנית, זה גם ניתן להבחין בתאים תת נוספים כלורופלסט. ואכן, מערכת קרום המעטפה מורכב הפנימי, את הקרומים המעטפה החיצונית (איור 1). עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, שיטה לטהר את המעטפה הפנימית והחיצונית ממברנות של תודרנית מהכלורופלסט נשאר שתוקם. המעטפה הפנימית והחיצונית ממברנות יכול להיטהר מן מהכלורופלסט22 21 או אפונה תרד. המגבלה העיקרית של תודרנית נובעת בעיקר הגבלת כמויות החל חומר. החל מ- 500 גרם של תודרנית עלים (אשר כבר מחייב 1 מ’ משטח2 בחדר צמיחה) מאפשר טיהור µg רק 100 של המעטפה חלבונים. מצד שני, קל להתחיל עם 5-10 ק ג תרד עלים מן השוק, לטהר את כמות גדולה של מהכלורופלסט8 , עם תשואה של 3-10 מ ג של המעטפה חלבונים מן החומר הזה.
אותו הדבר נכון עבור תאים תת תילקואיד. אכן, thylakoids עשויים אור קרום שלפוחית (lamellae) ומבנים צפוף (grana) (איור 1). פרוטוקולים ספציפיים זמינים להבחין בין אלה שני תאים תודרנית23,24. שוב, על סמך ניתוח כמותי פרוטאומיקס, אנחנו לאחרונה מטופלים החלבונים המצויים אלה שני תאים משנה24. גישות אלה, יחד עם חקירה מעמיקה של הספרות, מותר אימות, או מציע היפותזה עבור, המיקום subplastidial של מאות תילקואיד חלבונים. עם זאת, חשוב לציין כי microdomains ממברנה נוספים נמצאים בשולי מעוקל thylakoids. אלה תאים תת ליפופרוטאין, או plastoglobules, הם ביחד לצמיתות לממברנות תילקואיד ומכילים קבוצה ספציפית של חלבונים25. משתמש בפרוטוקול הנוכחי, ולכן בלתי אפשרי להבחין חלבונים ספציפיים אלה לבין רכיבים אחרים תילקואיד.
מקורית (ידוע) המעטפה, משתית או תילקואיד רכיבים מסוימים חסרים עדיין מתוך הרשימות של חלבונים שזוהו. יחד עם ניתוחים הביוכימי ו יישוב, שיפור מתמיד של MS רגישות יהיה לעזר רב לבקר את התוכן כלורופלסט לכיוון רפרטואר שלם של ההרכב של תאים תת השונים שלה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת הדוקטורט משותפת כדי ליברות ביולוגית הצמח INRA וחילוק הרבייה ומן את GRAL Labex (ANR-10-LABX-49-01). אנחנו רוצים גם להכיר את הפרוייקט ANR ANR-15-IDEX-02, ד ר אוליבייה ואלון (IBPC פריז) עבור נוגדנים נגד LHCP, ד ר רנוד דיומא (LPCV, גרנובל) עבור נוגדנים נגד של קארי.
Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
Tricine | Roth | 6977.2 | |
Sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | H5032 | |
NaHCO3 | Roth | 8551.1 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.5 | |
MgCl2 | Roth | 2189.1 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Benzamidine | Sigma | B6506 | |
ε-amino caproic acid | Fluka | 21530 | |
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) | Roth | 6979.3 | |
Sucrose | Roth | 9286.2 | |
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide | Roth | 3029.1 | |
Tris | Fisher | BP152-5 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Roth | 1057.1 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T-8133 | |
Ammonium persulfate (APS) | Roth | 9592.1 | |
Glycerol | Roth | 3783.1 | |
Bromophenol blue | USB | US12370 | |
Glycin | Roth | 3908.3 | |
Gel staining medium | Clini-sciences | GEN-QC-STAIN | |
Ethanol | CARLO ERBA | 528151 | |
NaCl | Euromedex | 1112-A | |
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
Fat-free milk powder | Régilait | ||
HCl | Fisher | H/1150/PB15 | |
KOH pellets | Sigma | 1.05012 | |
NaOH pellets | CARLO ERBA | 480507 | |
Anti-HMA1 antibody | Seigneurin-Berny et al, 2006 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-KARI antibody | Ferro et al, 2010 | Used at a 1:1000 dilution | |
Anti-LHCP antibody | Vallon et al, 1991 | Used at a 1:25,000 dilution | |
P-coumaric acid | Sigma | C-9008 | |
Luminol (3-aminophalhydrazin) | Fluka | 9253 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO). | Sigma | D5879 | |
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases | Puteaux | 162135 | |
A. thaliana seeds | Around 30 mg of seeds for a whole case | ||
Compost "Floragard" | Puteaux | 16311770 | |
Growth rooms | 12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s. | ||
Muslin or cheesecloth | Raffin | 70116 | 80-cm-large |
Nylon blutex 50 μm aperture | Tripette et Renaud, Sailly Saillisel | 50 μm aperture | |
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity | Waring Blender | ||
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles) | Beckman Coulter | ||
Beckman JA-20 rotor | Beckman Coulter | ||
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes) | Sorvall instruments | ||
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes) | Beckman Coulter | ||
Ultracentrifuge (Beckman L7) | Beckman Coulter | ||
Centrifuge (Beckman JSE-06D18) | Beckman Coulter | ||
Microcentrifuge | Eppendorf 5415D or equivalent | ||
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube. | |||
Nitrocellulose membranes | BA85, Schleicher and Schuell | ||
Filter paper | 3MM, Whatman, Maidstone | ||
Liquid nitrogen | |||
Peristaltic pump | Gilson | ||
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus). | Bio-Rad Protean 3 or equivalent | ||
System for protein transfer to nitrocellulose membranes | Bio-Rad Protean 3 or equivalent |