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Bioquímica

细胞细胞接触物蛋白质-蛋白质相互作用的荧光波动光谱测定

Published: December 01, 2018
doi:
10.3791/58582
,
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group,University of Potsdam

Summary

该协议描述了一种基于荧光波动光谱的方法来研究介导细胞相互作用的蛋白质之间的相互作用,即直接定位在细胞连接中的蛋白质。我们提供有关仪器校准、数据采集和分析的详细指南, 包括对可能的文物来源的更正。

Abstract

各种生物过程涉及细胞间的相互作用, 通常由蛋白质介导, 蛋白质在相邻细胞之间的界面上相互作用。有趣的是, 只有少数检测能够在活细胞中直接间接探测这种相互作用。在这里, 我们提出了一个检测方法, 以测量在邻近细胞表面, 在细胞接触表达的蛋白质的结合。该检测包括两个步骤: 混合表达与不同荧光蛋白融合的感兴趣蛋白质的细胞, 然后使用共聚焦激光扫描显微镜在细胞触点进行荧光波动光谱测量。我们通过测量淀粉样癌前吸附蛋白 (aplp1) 在细胞连接点上的相互作用, 在生物相关环境中证明了这种检测方法的可行性。我们提供了使用基于荧光的技术 (扫描荧光相关光谱、互相关数和亮度分析) 和所需的仪器校准进行数据采集的详细协议。此外, 我们还讨论了数据分析中的关键步骤, 以及如何识别和纠正外部、虚假信号的变化, 例如由于光漂白或细胞运动而产生的变化。

一般情况下, 该检测方法适用于细胞接触时、相同或不同类型细胞之间的任何同型或异型蛋白质相互作用, 可在商业共聚焦激光扫描显微镜上实施。一个重要的要求是系统的稳定性, 这需要足以探测感兴趣的蛋白质在几分钟内的扩散动力学。

Introduction

许多生物过程发生在细胞相互作用的部位,例如细胞粘附1、2、3、细胞融合4和细胞识别5。这类事件在多细胞生物的发展和细胞细胞交流 (例如免疫反应期间) 中尤其重要。这些过程通常由蛋白质介导, 这些蛋白质被定位在表面,即在相邻细胞的质膜 (pm), 并在细胞接触时进行特定的相互作用, 这些相互作用在空间和时间上得到精确的调节。在许多情况下, 这些相互作用是直接的同型或异型蛋白质-蛋白质-蛋白质反式相互作用, 但也可能涉及离子或配体作为细胞外链接剂 1。虽然具有根本的重要性, 但缺乏直接在活细胞的本地环境中探索这些特定蛋白质-蛋白质相互作用的检测方法。许多方法要么需要细胞破坏 (例如生化检测, 如共同免疫沉淀6)、固定 (例如,一些超分辨率光学显微镜和细胞的电子显微镜)联系人 7), 或非特异性,例如,聚合/粘附检测8,9。为了解决这一问题, 在荧光共振能量传递 (fret)10或荧光互补11的基础上, 实现了荧光技术。然而, 为了在荧光体之间实现足够小的距离, 这些方法需要在蛋白质10的细胞外侧贴上荧光标签, 这可能会干扰反式相互作用。

在这里, 我们提出了一种替代荧光为基础的检测蛋白质相互作用在细胞接触。这种方法结合了荧光相关的方法 (扫描荧光相关光谱 (sfccs), 相关的数字和亮度 (ccn & amp; b)) 和混合细胞表达融合结构的蛋白质兴趣,例如,粘附受体。两个相互作用细胞中的研究受体被标记为两个光谱分离的荧光蛋白 (fp), 从细胞内侧 (见图 1a)。

所采用的方法是基于对荧光融合蛋白通过共聚焦激光扫描显微镜焦体积扩散运动引起的荧光波动的统计分析。更详细地说, 该分析探讨了在细胞细胞接触时两个相邻的 pm 中感兴趣的蛋白质的共同扩散。如果这些蛋白质经历反式相互作用, 这些反式复合物将携带荧光蛋白在两个光谱通道中发射, 从而导致两个发射体的相关荧光波动。另一方面, 如果没有结合发生, 面对 pm 的蛋白质数量波动将是独立的, 不会造成相关的波动。采集可以通过两种方式进行: 1) sfccs 基于跨细胞接触的线形扫描, 并在接触区域的位置有效地探测相互作用。通过荧光波动的时间分析, sfccs 还提供动力学信息,即蛋白质复合物的扩散系数;2) ccn & amp; b 基于对在细胞接触区域获得的一系列图像的像素化分析。它有能力探测和绘制整个接触区域 (在一个焦平面上) 的相互作用, 但不提供动力学信息。这两种方法都可以与分子亮度的分析相结合,即单个扩散蛋白质复合物在时间单位中发出的平均荧光信号, 从而提供蛋白质复合物的化学计量估计。细胞联系人。

在本文中, 我们提供了详细的协议样品制备, 仪器校准, 数据采集和分析, 以执行所提出的检测在商业共聚焦激光扫描显微镜。实验可以在任何配备光子计数或模拟探测器的仪器上进行, 也可以在高数值孔径的目标上进行。我们进一步讨论了协议的关键步骤, 并为导致人工制品事实信号波动的几个过程提供了校正方案,例如探测器噪声、光漂白或细胞运动。该检测最初是为探测粘附细胞之间的相互作用而开发的, 可针对悬浮细胞进行改性, 或适用于模型膜系统,例如巨大的单形囊泡 (guv) 或巨大的质膜囊泡 (gpmv), 从而允许定量的相互作用在不同的脂质环境或在没有一个有组织的细胞骨架12,13。

扫描荧光相关光谱是荧光相关光谱14的一个修正版本, 是专门为探测脂膜15中的慢扩散动力学而设计的。它是基于垂直于 pm 包含感兴趣的荧光蛋白的线扫描采集。为了探测两个不同标记的蛋白质物种的相互作用, 利用两条激光线和两个光谱分离荧光检测窗口, 在两个光谱通道中进行采集。由于 pm 中蛋白质的缓慢扩散动力学 (D≤~1 μm2/),可以通过将激发方案从一行到15号线交替来进行无交叉对话的测量。分析从: 1) 基于 ~ 1000 线的块平均的侧向细胞运动的对齐算法校正, 2) 用最大荧光信号确定位置, 即每个块中的 pm 位置和 3) 移位所有块到一个共同的起源12,15, 分别在每个通道。然后, 通过从所有对齐线 (即中心±2.5) 之和的高斯拟合中选择中心区域来执行与 pm 相对应的像素的自动选择。信号在每条线路中的集成产生膜荧光时间序列f ( t) 在每个通道 (g = 绿色通道, r = 红色通道)。请注意, 像素大小必须足够小,例如, & lt;200 nm, 以重建点传播函数的形状并找到其中心, 对应于 pm 的位置。在存在大量光漂白的情况下, 每个通道中的荧光时间序列可以用双指数函数建模, 然后用以下公式进行校正:16

Equation 1.   (2)

需要注意的是, 与未校正的 f (t) 获得的参数估计相比, 该公式有效地纠正了从f (t)c的相关分析中获得的振幅和扩散时间。然后, 计算荧光信号的自相关和互相关函数 (acfss/ccf):

Equation 2, (2)

Equation 3, (3)

其中f i = fi(t)- Image 1 fi (t)Image 2 和i = g, r。

然后将二维扩散模型安装到所有相关函数 (cfs) 上:

Equation 4.  (2)

在这里, n表示观察体积中荧光蛋白的数量, 每个通道的 扩散时间。该模型考虑到在所述的实验设置中, 蛋白质在 pm 中的扩散发生在 x-z 平面上, 这与通常使用的荧光相关光谱 (fcs) 实验在膜探测上的配置形成了对比扩散在共聚焦体积17的 x-y 平面上。腰 w0和结构因子 s, 描述 z, s = w z /w w w w 0 中焦距体积的伸长率 w z, 是通过光谱相似染料和相同光学设置进行的点 fcs 校准测量得到的使用扩散系数d染料的现有值:

Equation 5, (5)

其中,染料是染料分子的测量平均扩散时间, 是通过将三维扩散模型拟合到数据中获得的, 同时考虑到所有n分子中的一小部分t向具有时间常数的三胞胎状态:

Equation 6.  (5)

最后, 扩散系数 (d)、分子亮度值 () 和 sfccs 数据的相对相互关系计算如下:

Equation 7, (7)

Equation 8, (8)

Equation 9, (9)

其中g交叉(0) 是互相相关函数的振幅, 是 Equation 14 i 通道中自相关函数的振幅。

相对交叉相关的这一定义,即在公式9中使用最大值而不是平均值, 考虑到在不同浓度下存在的两个蛋白质物种的最大配合物数量受到在一个较低的数量存在的物种。

交叉相关数字和亮度基于对图像堆栈中每个像素的荧光强度的时刻分析, 这些像素是在样品中的一个固定位置获得的, 通常由大约100-200 帧组成, 具有两个光谱通道 (g = 绿色通道, r = 红色通道)。从时间均值Image 1 iImage 2 i 和方差Equation 16 , 计算了每个像素和光谱通道 (i = g, r)18中的分子亮度i和数字n i:

Equation 10, (10)

Equation 11.(10)

需要注意的是, 给定的方程适用于真正的光子计数探测器的理想情况。对于模拟检测系统, 适用以下公式 19、20:

Equation 12, (12)

Equation 13.  (13)

在这里, s 是检测到的光子和记录的数字计数之间的转换Equation 24因子, 是读出噪声和偏移量是指探测器的强度偏移。一般来说, 对于任何探测器类型, 这些数量都应根据测量探测器的方差作为稳定照明的强度函数进行校准 19,例如, 反光金属表面或干燥的染料溶液。偏移量可以通过测量没有激发光的样品的计数率来确定.通过对检测器关联Equation 25的方差与强度 (i) 图 (i) 进行线性回归, 可以Equation 24确定19:

Equation 14.  (14)

最后, 计算每个像素的互相关联亮度, 并将一般定义为21

Equation 15, (15)

交叉Equation 29方差Equation 30在哪里。

为了过滤长寿命波动, 所有 ccn & amp; b 计算都是在箱车过滤后进行的, 每个像素22独立执行。简单地说, ni、 i (i = g, r) 和bcc 是在滑动段中计算的,例如, 8-15 帧。这样得到的值可以进行平均, 以获得最终的像素号和亮度值。

肌细胞计量学分析
为了估计细胞接触中蛋白质配合物的化学计量, 可以分别分析 sfccs 或 ccn & amp; b 数据在每个光谱通道中的分子亮度。在 sfccs 中, 每个通道的每次测量都会获得一个亮度值。在 ccn & amp; b 中, 得到了与细胞接触相对应的所有像素的亮度直方图, 平均 (或中值) 可以作为测量的代表性亮度。通过对单体参考进行相同的分析, 可以对所有亮度值进行归一化, 直接获得检测到的蛋白质复合物的平均寡聚状态。在这一点上, 重要的是要纠正存在的非荧光 fp, 这可能会导致低估寡聚状态。这通常是通过使用单色 sfcs 或数字和亮度 (n & amp;b ) 测量同源参考蛋白23、24的亮度来实现的。

Protocol

1. 样品制备: 细胞混合检测 注: 以下协议描述了粘附细胞的混合过程。对于悬浮培养的细胞, 可以对其进行修饰。 在转染前一天, 在6孔板上播种适当数量的细胞,例如 800 , 000 hek 293t 细胞 (用 neubauer 计数室计数)。该数字可以根据播种和转染之间的时间进行修改, 并根据其他细胞类型进行调整。要进行基本实验 (即感兴趣的蛋白质和负对照), 准备至少4口井。在…

Representative Results

蛋白质-蛋白质相互作用试验的第一次测试,即混合表达光谱不同荧光蛋白的细胞, 然后进行 sfcccc/ccn & amp; b 测量 (图 1), 应在预计不会进行的蛋白质上进行。在细胞接触时相互作用 (即负对照)。因此, hek 293t 细胞表达了肌动板-棕榈列-老年肌 (myr-palm-myfp) 或-md拨号 fl (myr-palm-meyfp), 并在细胞接触中进行了 sfccs (图 2<…

Discussion

通过这里描述的实验过程, 可以利用荧光波动光谱技术, 即 sfccs 和 ccn & amp; b, 研究细胞接触中的蛋白质-蛋白质-蛋白质反式相互作用。这些方法包括对两个光谱分离的 fp 在两个相邻细胞的接触下融合到感兴趣的蛋白质中发出的荧光波动进行统计分析, 每个细胞表达一个或另一个融合蛋白。反式复合物的存在是通过探索蛋白质在相邻的 pm 中的共扩散程度来量化的。除了关于样品制备、?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了德国基金254850309的部分支持。作者感谢马德伦·卢克纳对手稿的批判性解读。

Materials

DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110
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Referências

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. . Molecular biology of the cell. , (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -. M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Biologia do Desenvolvimento. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -. Y., Mok, L. -. P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. . Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010)
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

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Citar este artigo
Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).
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