Analyse de la dynamique de l'actomyosine à l'échelle locale cellulaire et tissulaire à l'aide de films time-lapse de chambres d'oeufs drosophila cultivées
Summary
Ce protocole fournit une méthodologie basée sur les Fidji, conviviale avec des instructions simples expliquant comment analyser de façon fiable le comportement de l’actomyosine dans les cellules individuelles et les tissus épithéliales courbés. Aucune compétence en programmation n’est requise pour suivre le tutoriel; toutes les étapes sont effectuées de manière semi-interactive à l’aide de l’interface utilisateur graphique de Fidji et des plugins associés.
Abstract
Les œufs immatures de Drosophila sont appelés chambres d’oeufs, et leur structure ressemble aux organes primitifs qui subissent des changements morphologiques d’un rond à une forme ellipsoïde pendant le développement. Ce processus de développement est appelé oogenesis et est crucial pour générer des œufs matures fonctionnels pour sécuriser la prochaine génération de mouches. Pour ces raisons, les chambres à œufs ont servi de modèle idéal et pertinent pour comprendre le développement des organes animaux.
Plusieurs protocoles de culture in vitro ont été développés, mais il y a plusieurs inconvénients à ces protocoles. L’une consiste à appliquer diverses couvertures qui exercent une pression artificielle sur les chambres d’œufs imageafin de les immobiliser et d’augmenter le plan d’acquisition imagede de la surface circonférence des chambres d’oeufs analysées. Une telle approche peut influencer négativement le comportement de la machinerie actomyosine mince qui génère la puissance de faire pivoter les chambres d’oeufs autour de leur axe plus long.
Ainsi, pour surmonter cette limitation, nous culture Drosophila chambres d’oeufs librement dans les médias afin d’analyser de façon fiable machines actomyosin le long de la circonférence des chambres d’oeufs. Dans la première partie du protocole, nous fournissons un manuel détaillant comment analyser la machinerie d’actomyosine dans un plan d’acquisition limité à l’échelle cellulaire locale (jusqu’à 15 cellules). Dans la deuxième partie du protocole, nous fournissons aux utilisateurs un nouveau plugin basé à Fidji qui permet l’extraction simple d’une mince couche définie de la surface circonférence des chambres d’oeufs. Le protocole suivant décrit ensuite comment analyser les signaux d’actomyosine à l’échelle des tissus (cellules de 50). Enfin, nous repérons les limites de ces approches à la fois à l’échelle cellulaire et tissulaire locale et discutons de son développement futur potentiel et des applications possibles.
Introduction
Le développement continu de nouvelles technologies d’imagerie et de logiciels avec des applications dans les sciences de la vie a eu un impact énorme sur la compréhension des principes de base de la vie. L’un des principaux défis est la visualisation fiable des processus de développement en combinaison avec leur imagerie en direct dans divers tissus. Les tissus font partie des organes et des corps et, en tant que tels, la majorité d’entre eux ne sont pas facilement accessibles pour l’imagerie. Par conséquent, des protocoles qui permettent leur dissection et la culture in vitro ont été développés afin de visualiser des événements biologiques qui reflètent suffisamment la situation in vivo au sein d’un corps vivant.
Au cours des dernières décennies, la culture et l’imagerie vivante des chambres d’œufs Drosophila, des structures semblables à des acinars ressemblant à des organes primitifs, ont énormément contribué à la compréhension des principes de base du développement des organes primitifs1 , 2 (en) , 3. Actuellement, il existe plusieurs protocoles de culture, et leur utilisation dépend du temps d’acquisition, du type de cellule à imager et de leur accessibilité (p. ex., lignée germinale interne par rapport à la ligne somatique extérieure)4.
Une caractéristique commune dans tous ces protocoles de culture est la nécessité de l’immobilisation des chambres d’oeufs analysées qui montrent une activité contractile élevée dans les médias liquides. L’activité contractile des chambres d’oeufs est causée principalement par la feuille de muscle qui couvre une longue chaîne de chambres d’oeufs connectés5,6,7. Par conséquent, pour parvenir à l’immobilisation appropriée des chambres d’oeufs jeunes, diverses approches ont été développées, impliquant la couverture des chambres d’oeufs avec des couvertures6,8,9 ou des couvertures flexibles4, 10 ou les intégrer dans l’agarose à faible point de fusion3,11. Ces approches sont populaires car elles permettent également l’imagerie d’un plan visuel plus grand en raison de l’aplatissement subtil de la surface circonférence des chambres d’oeufs.
Cependant, récemment, il a été démontré que les jeunes chambres d’oeufs (stade 1-8) tournent autour de leur axe antérieur-postérieur6 et que ce mouvement de tissu est actionné par un réseau fin d’actomyosine près de la surface circonférence de ces jeunes chambres d’oeufs 12. Par conséquent, l’altération artificielle de la surface cellulaire provoquée par un aplatissement subtil de ce tissu peut avoir un impact négatif sur le comportement de la machinerie d’actomyosine génératrice de force. Le contrepoint est que si le tissu de la chambre d’oeuf s’est aplati, l’imagerie microscopique des protéines à la surface circonférence des chambres d’oeufs devient encore plus limitée par la taille diminuée du plan d’acquisition.
Par conséquent, nous avons combiné des protocoles de Prasad et coll.9 et du laboratoire de Celeste Berg4,10 et nous les avons modifiés de façon à ce qu’aucune couverture/couverture flexible/agarose ne soit utilisée dans la méthode développée. Les chambres d’oeufs drosophiles sont librement cultivées dans les médias et le protocole présenté ici ne s’applique qu’à la microscopie inversée. Il y a deux parties au protocole. La première partie est axée sur l’analyse des signaux d’actomyosine à l’échelle cellulaire locale (jusqu’à 15 cellules) dans les chambres d’oeufs. Dans la deuxième partie, nous nous concentrons sur le dépassement des limites associées à un petit plan d’acquisition causé par la culture libre des chambres d’oeufs. À cet égard, nous avons développé une nouvelle méthode de calcul basée sur Fidji avec une interface utilisateur graphique semi-interactive qui extrait sélectivement et déploie des couches définies d’une surface tissulaire circonférence. Ceci est suivi d’un protocole qui décrit comment analyser l’actomyosine à l’échelle tissulaire (c.-à-d., les cellules de 50). Comme l’extraction sélective d’une fine couche définie de tissus épithélials incurvés n’a pas été facilement possible à l’aide d’une projection classique de z-stack (Figure 1), cette méthode facile à utiliser sert de condition préalable importante pour comprendre comportement d’un mince réseau d’actomyosine à l’échelle tissulaire dans les chambres d’oeufs de Drosophila.
En outre, pour faciliter le protocole, nous fournissons des exemples de films en time-lapse (TLMs) et des fichiers d’exemples de comportement myosin II non musclé fluorescent (voir Dossier supplémentaire 3). Myosin II est une protéine motrice et représente la partie contractile active de la machinerie actomyosine. Afin d’imageMyosin II, nous utilisons des lignes transgéniques Drosophila qui contiennent une chaîne de lumière réglementaire modifiée de Myosin II appelé MRLC::GFP (voir tableau des matériaux pour plus de détails)12,13. Afin de visualiser les membranes cellulaires, le protocole est basé sur des colorants commerciaux (voir Tableau des matériaux). Ce protocole convient non seulement à l’analyse de petits signaux subcellulaires MRLC::GFP12, mais aussi pour toutes les particules subcellulaires de taille similaire autour de 300 m, telles que celles observées avec Life-Act::GFP12,14.
Bien que ces deux protocoles soient présentés à l’aide de chambres d’œufs drosophila de culture in vitro, l’acquisition de signaux d’actomyosine peut également être effectuée à l’aide d’autres tissus lors de l’optimisation des supports de culture et en fonction de la disponibilité des protéines étiquetées fluorescentes avec des colorants commerciaux correspondants ou, par exemple, des microinjections d’ARNm pour obtenir des profils transitoires d’expression génique. De même, le protocole basé aux Fidji pour l’extraction d’une couche mince à partir d’une surface circonférence peut être appliqué plus généralement sur les tissus ellipsoïdes et organiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques et dépannage pour la dissection et la culture des chambres d’oeufs
Si trop de mouches sont placées dans une petite fiole, la nourriture de mouche peut devenir boueuse après 2-3 jours en raison des quantités étendues de larves d’alimentation et les mouches adultes se coincer dans la nourriture de mouche. Dans un tel cas, retournez le reste de ces mouches dans une nouvelle fiole avec des aliments frais et réduire leur nombre. En particulier, exclure les f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont très reconnaissants à Miriam Osterfield pour partager ses conseils sur l’imagerie de la vie in vitro des chambres d’oeufs en utilisant une approche adoptée par le laboratoire Celeste Berg4. Nous remercions également Sebastian Tosi pour le script Fidji qui permet la segmentation cellulaire.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
Referências
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