HUVEC трубообразования Анализ для оценки воздействия натуральных продуктов на ангиогенез
Summary
Здесь мы оцениваем влияние экстракта воды Рута graveolens на формирование сети судов с помощью трубки формирования асссировки на гелеобразной матрицы подвала.
Abstract
Ангиогенез является явление, которое включает в себя различные процессы, такие как пролиферация эндотелиальных клеток, дифференциация и миграция, которые приводят к образованию новых кровеносных сосудов и включают в себя несколько путей трансдукции сигнала. Здесь мы показываем, что анализ формирования трубки является простым методом in vitro для оценки влияния натуральных продуктов на ангиогенез и для исследования молекулярных механизмов. В частности, в присутствии экстракта воды Рута graveolens (RGWE), эндотелиальные клетки больше не в состоянии сформировать сеть клеток и что RGWE воздействие на человека пупочной вены эндотелиальной клетки (HUVEC) образование трубки отменяется составной активации МЭК.
Introduction
Ангиогенез является физиологическим процессом, который приводит к образованию новых кровеносных сосудов из уже существующих и происходит во время эмбриогенеза и роста органов. В зрелом возрасте ангиогенез активируется только в велосипедных яичниках, в плаценте во время беременности, а также во время заживления ран и ремонта. Ангиогенез зависит от способности эндотелиальных клеток размножаться, дифференцироваться и мигрировать, образуя нетронутую сосудистую сеть1. Однако при некоторых нарушениях, таких как воспалительные, метаболические и ревматические заболевания, изменяются ангиогенные процессы и становится чрезмерным ангиогенез. Кроме того, неконтролируемые ангиогенные процессытакже стимулируют прогрессирование опухоли и метастазирование 1. По этим причинам, в последнее десятилетие, исследования сосредоточены на разработке новых терапевтических стратегий, направленных на ингибирование чрезмерного ангиогенеза при раке, глазной, суставной или кожных заболеваний2,3.
Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) представляет собой основную цельтекущей антиангиогенной терапии 4, и несколько анти-VEGF моноклональных антител были разработаны и синтезированы для предотвращения чрезмерного ангиогенеза. Тем не менее, эти синтетические наркотики показывают серьезные побочные эффекты и имеют неблагоприятное соотношение затрат на выгоду5,6. Поэтому крайне важно найти новые терапевтические стратегии, чтобы ограничить чрезмерный ангиогенез с минимальными побочными эффектами, чтобы дополнить и в сочетании с в настоящее время используется наркотиков. Эти новые препараты можно найти среди натуральных продуктов, которые характеризуются высоким химическим разнообразием и биохимической спецификой.
В этой статье мы предлагаем простой метод для оценки влияния RGWE на способность HUVECs формировать трубочки на гелеобразной матрице подвала in vitro5. Действительно, RGWE представляет собой смесь вторичных метаболитов, таких как флавоноиды и полифенолы, среди которых колея является основным компонентом5. Многие из них уже протестированы как противовоспалительные и вазопротекторные средства7,8,9,10,11. Кроме того, мы недавно показали, что RGWE, но не rutin, способен подавлять способность HUVEC формировать трубочки на гелеобразной матрице подвала и что это явление опосредовано meK-ERK путь, указывая RGWE в качестве потенциального терапевтического инструмента, способного предотвратить чрезмерное образование новых кровеносных сосудов5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Природные соединения характеризуются высоким химическим разнообразием и биохимической специфичностью и представляют собой источник потенциально терапевтических молекул. Здесь мы покажем, как получить экстракт воды из завода R. graveolens и предлагаем исследование образования трубк…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Fondi ди Ateneo Лука Колуччи-D’Amato и VALERE Программа средств Для Марии Терезы Джентиле и AIRC фонд IG18999 Маурицио Bifulco.
Materials
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 um filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
Referências
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro Models of Angiogenesis. World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
