Denne protokol diagnoser Tilapia søen Virus (TiLV) i tilapia væv ved hjælp af RT-PCR metoder. Den hel metode er beskrevet af væv dissektion til total RNA udvinding, efterfulgt af cDNA syntese og påvisning af TiLV af enten konventionel PCR eller kvantitativ PCR ved hjælp af dsDNA bindende en fluorescerende bindende farvestof.
Formålet med denne metode er at lette hurtig, følsom og specifik påvisning af Tilapia søen Virus (TiLV) i tilapia væv. Denne protokol kan bruges som en del af programmer, overvågning, biosikkerhedsforanstaltninger og i TiLV grundlæggende forskningslaboratorier. Guldstandarden af virus diagnostik involverer typisk virusisolation efterfulgt af supplerende teknikker som reverse-transskription polymerase kæde reaktion (RT-PCR) for yderligere kontrol. Det kan være besværligt, tidskrævende og kræver typisk vævsprøver tungt inficeret med virus. Brugen af RT-kvantitative (q) PCR i påvisning af virus er fordelagtig på grund af dens kvantitative natur, høj følsomhed, specificitet, skalerbarhed og dens hurtig tid til at føre. Her, baseret den hel metode af PCR tilgange til TiLV opdagelse er beskrevet fra tilapia orgel skæring, samlede ribonukleinsyre (RNA) udvinding ved hjælp af en guanidium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform løsning, RNA kvantificering, efterfulgt af en to-trins PCR protokollen indebærer, supplerende deoxyribonukleinsyre (cDNA) syntese og påvisning af TiLV af enten konventionel PCR eller kvantitative identifikation via qPCR bruger SYBR green jeg farve. Konventionelle PCR kræver post-PCR skridt og vil blot informere om tilstedeværelsen af virus. Den sidstnævnte tilgang vil gøre det muligt for absolut kvantificering af TiLV ned til så lidt som 2 eksemplarer og er således særdeles nyttigt for TiLV diagnose i sub kliniske tilfælde. En detaljeret beskrivelse af de to PCR tilgange, repræsentative resultater fra to laboratorier og en grundig diskussion af de kritiske parametre for begge har været medtaget for at sikre, at forskere og bilinspektionsteknikere finde deres mest egnede og relevante metode til TiLV påvisning.
Globale indbygger fisk levering nået en ny rekord på 20 kg i 2014 og det var på grund af kraftig vækst i akvakulturen. Akvakultur er fortsat en af de hurtigst voksende dyrefoder producerende sektorer på verdensplan og er det eneste animalske fødevareproduktion sektor, der vokser hurtigere end den menneskelige befolkning1. Tilapiine cichilds omfatter den næstvigtigste ferskvandsfisk opdrættet på verdensplan med en samlet global produktion af 6.4 millioner tons (MT) og en anslået værdi om 9,8 milliarder amerikanske dollars i 20152. De ti bedste producenter af tilapia er Kina (1,78 MT), Indonesien (1,12 MT) og Egypten (0,88 MT), efterfulgt af Bangladesh, Vietnam, Filippinerne, Brasilien, Thailand, Colombia og Uganda2. Det forventes, at globale tilapia produktion vil være omkring 7,3 MT af 20303. Tilapia er blevet en vigtig global fødekilde, ikke blot fordi de er en billig kilde til protein4 men også fordi de er nemme at opdrætte i kapacitet under en bred vifte af vand og klima forhold5,6. Bare et par årtier siden, mente man at der var få kommerciel betydning sygdomme truer tilapia landbrug, men dette er ikke længere sandt. En ny viral sygdom kaldet tilapia søen virus sygdom (TiLVD) er den første nogensinde kritiske sygdomsepidemi fundet i tilapia og hele branchen er i fare. Denne sygdom har alvorlige socioøkonomiske konsekvenser og er en direkte trussel om fødevaresikkerhed for millioner af mennesker i Afrika7, Asien og Sydamerika. I starten af 2018 rapporterede Verdensorganisationen for Dyresundhed (OIE), at den ætiologiske agent for denne sygdom, TiLV, havde konstateret officielt, på tre kontinenter, der dækker otte lande8 , og da dette patogen oplysningskort var opdateret der har været flere rapporter om TiLV i Tanzania, Uganda9, Indonesien10, Taiwan11 og Peru12. TiLV er en roman enkeltstrenget RNA-virus beskrevet for at være en orthomyxo-lignende virus, fordi det indeholder en bred vifte af egenskaber der minder om andre orthomyoxoviruses såsom Influenza eller infektiøs lakseanæmi virus (ISAV)13. Det blev først identificeret i kølvandet på store tab af af vilde og opdrættede tilapia i søen Galilæa, Israel14. Derefter omhandlet lignende sygdomsudbrud, som sommeren mortalitet og én måned dødelighed syndrom tilknyttet TiLV infektion blev rapporteret i Nilen tilapia (Oreochromis niloticus) i Egypten15 og Nilen og red hybride tilapia (Oreochromis spp.) i Thailand16, henholdsvis. Påvisning af akvatiske dyr vira er historisk set udført af vækst og isolering af virus i cellekultur. Forskellige cellelinjer er blevet testet for formering og dyrkning af TiLV herunder, E-11 celler stammer fra snakehead fisk (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB og TmB stammer fra Oreochromis mossambicus18, og OnlB og OnlL stammer fra Nilen tilapia (O. niloticus)19. Mens virus kultur har den fordel, at det giver materiale til yderligere forsøg, har det den ulempe, at det kræver mindst 4-7 dage til at observere dannelsen af cytopatisk effekt (CPE) og afgørende, forskellige piscine vira, der er mere egnet til kopiere kan overføres og producerer lignende CPE.
I de seneste årtier, har der været en bevægelse væk fra traditionel, ofte tidskrævende diagnostiske metoder såsom cellekultur, serologi og antigen afsløring og udskiftning med hurtigere og mere følsomme nukleinsyre baseret detektion tests20, 21. Det fremgår klart af det faktum, at mange qPCR assays er blevet udviklet som vigtige diagnostiske metoder for en lang række virale sygdomme hos vanddyr, som for ISAV22,23, egtvedsyge virus (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 laksefisk alphavirus28, fisk iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30, og Lymphocystis disease virus (LCDV)31 . Robuste metoder til diagnosticering og patogen overvågning er tvingende nødvendigt at mindske spredningen af TiLV. Sådanne metoder bør give mulighed for tidlig påvisning af infektion før kliniske symptomer udvikler og påvisning af lav virus belastninger. Til dato har forskellige PCR-protokoller, herunder RT-PCR14,32, er indlejrede RT-PCR18, semi-indlejrede RT-PCR33og RT-qPCR32,34 blevet udviklet til påvisning af TiLV i fiskevæv. En sammenligning af RT-qPCR og virus isolation i modtagelige cellelinjer til TiLV påvisning afslørede, at RT-qPCR var 1.000 gange mere følsom end virus isolation32. Selv om hver offentliggjorte PCR-protokol har rapporteret forskellige følsomheder til påvisning af TiLV, er de fleste assays meget følsomme med påvisningsgrænserne for viral kopier på 7,5 Kopier33, 7 eksemplarer18 eller 2 kopier32 per reaktion.
Formålet med denne metoder artikel er at forklare i detaljer, hvordan man udfører TiLV påvisning assays, begyndende med tilapia væv samling, at total RNA udvinding, cDNA syntese og derefter TiLV specifikke PCR baseret assays. Specifikt, er omfattende protokoller af både konventionelle RT-PCR, og også SYBR green-baserede RT-qPCR blevet beskrevet til at appellere til en bred vifte af forskere med det formål at opdage TiLV. Førstnævnte er mindre følsomme, men er typisk en billigere mulighed for detektion. Sidstnævnte kræver mere omfattende infrastruktur såsom en kvantitativ PCR-maskine og dyrere reagenser, men det har fordelene ved at være kvantitative, hurtig og meget følsomme, hvilket betyder, at det kan anvendes til påvisning af TiLV i sub klinisk inficerede fisk. RT-PCR og RT-qPCR protokoller blev udført på to forskellige laboratorier med adskilte geografiske isolater af TiLV og inkluderet resultater højdepunkt følsomheden og reproducerbarhed af assays beskrevet her.
TiLV blev først rapporteret i 2014 i Israel14 og siden da er det blevet identificeret i flere lande, herunder Egypten, Colombia, Indien, Malaysia, Uganda, Tanzania og Thailand15,16,18, 35 , 48. globale bevidsthed, især tilapia producerende lande har placeret mere opmærksomhed på virus og forskellige restriktioner og kontrolforanstaltninger fra offentlige myndigheder har gennemført forsøg på at forhindre spredning af TiLV. Her, er en detaljeret protokol for TiLV påvisning i tilapia væv, der dækker prøvetagning, RNA isolering, cDNA syntese, PCR og qPCR assays blevet forklaret. Der er forskellige aspekter til disse metoder, der garanterer specifikke drøftelse. TiLV er blevet identificeret i fisk, der spænder over en række størrelser9,12,14,15,49 og arter af tilapia hidtil, herunder opdrættet hybrid tilapia (O. niloticus x O. aureus)11,14, Nile tilapia (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 og rød tilapia (Oreochromis sp.)16,33,48,51, som godt som i vilde Nilen tilapia9,12, sort tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus og T. simonis intermedia14 og ganske nylig TiLV blev identificeret i vilde karper (Barbonymus schwanenfeldii)52. Vævsprøver fra indre organer (gill, milt, leveren, hjerte, hoved nyre) eller slim37 kan blive indsamlet fra sunde samt døende tilapia uanset alder, størrelse eller arter og forarbejdet til RNA isolering. Den samlede RNA udvinding protokol skitseret bruger her en monofasiske løsning af phenol og guanidinium kaliumthiocyanat, som er en chaotropic denaturering agent. Væv er direkte homogeniseret i denne løsning, efterfulgt af tilsætning af chloroform og centrifugering at opnå faseseparation hvori en klar RNA indeholdende øverste vandfasen, en interfase og en lavere organiske fase er genereret. RNA er isoleret fra den vandige fase af isopropanol nedbør, efterfulgt af vask af det gendannede RNA kan slippe af forurenende stoffer. Isolering af RNA ved denne metode var pioner af Piotr Chomczynski og Nicoletta Sacchi og blev omtalt som guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform udvinding53,54. Denne type af reagens, der anvendes til RNA udvinding kan være kommercielt købt eller fremstillet i laboratoriet (Se Tabel af materialer for yderligere oplysninger). Denne protokol tager lidt længere tid end kolonne-baserede metoder såsom kvarts-baserede rensning, men generelt, det er mere omkostningseffektive og giver mere RNA.
I denne protokol, kvantificere RNA ved hjælp af A260 værdier blev skitseret hvorved spektrofotometri værdier kan angive RNA kvalitet (A260/A280 = 1,9-2,1). Mens denne metode vil give en god indikation af prøven renhed, kan det absolut informere om kvaliteten af den udpakkede RNA. Bestem ordentligt om RNA er intakt eller delvist nedbrudte, prøver kan være separation ved agarosegelelektroforese gelelektroforese hvori udtværing af EtBr farves 18S og 28S rRNA bands angive RNA nedbrydning. Yderligere kontrol af RNA kvalitet kan omfatte hjælp af en lab-on-a-chip instrument. Derudover er det også vigtigt at fordøje den oprensede RNA med DNase jeg fjerne forurener vært genomisk DNA, som afhængigt af de downstream applikationer kan føre til forkerte resultater. Hvis værten gDNA stadig forurener RNA prøven i vid udstrækning, en supplerende DNaseI behandling kan også udføres i slutningen af RNA udtræk procedure (Se Tabel af materialer).
Supplerende DNA syntese kan i høj grad påvirke de samlede qPCR resultater og er et aspekt af den metode, der kan indføre variation. CDNA protokollen anbefalet her består af en enkelt komponent set-up bruger oligo (dT) og dermed kun transcribes mRNAs indeholdende polyA haler. Det giver brugerkontrol af præcis hvilke komponenter kan bruge til reverse transkription reaktion og denne tilstand af cDNA syntese er lykkedes TiLV påvisning32. Et alternativ til dette set-up er en kommercielt købte master-blanding indeholdende alle komponenter, der kræves til reverse transkription reaktion og er meget hurtig og enkel uden de sædvanlige Multi-trins, pipettering og multitemperatur protokol. Dette er en fordel fordi det minimerer håndtering og fremmer ensartethed på tværs af alle prøver. Sådan master-blander ofte omfatter både oligo(dT) og tilfældige primere gør det relevant at forskellige RNA skabeloner og generering af repræsentative cDNA kopier af sekvenser fra hele længden af RNA’er i en population (viral og tilapia vært mRNA) og i teorien, alle ønskede RNA arter kan derefter måles ved konventionelle PCR eller qPCR fra sådan en prøve. Denne alsidighed er den største fordel ved en 2-trins RT-PCR tilgang; Det giver en langsigtet pulje, der kan bruges til mange forskellige eksperimenter. En et-trins RT-PCR tilgang har været repræsenteret i resultaterne, hvori sekvens specifikke primere (tabel 1) blev brugt og RT og PCR blev udført i et rør (Se materiale liste). I almindelighed, sekvens specifikke primere giver mulighed for en højere RT effektivitet af det specifikke mål RNA end ved hjælp af tilfældige priming, men det specifikke mål RNA er den bare sig at kan kvantificeres i sådan en cDNA prøve, som kan være den eneste mål af visse laboratorier (Se Tabel af materialer for cDNA syntese produktforslag).
Mens konventionelle RT-PCR synes at være almindeligt anvendt hidtil i TiLV diagnose9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR har vist sig at være et mere effektivt redskab for påvisningen og kvantificeringen af små mængder af TiLV i fiskevæv eller slim32,37. I almindelighed, er qPCR udbredt i klinisk virologi diagnostiske laboratorier på grund af sin høje følsomhed, specificitet, god reproducerbarhed, bredt dynamikområde og hastighed21. Mens qPCR kan være i første omgang dyrere at implementere end konventionelle RT-PCR, giver det mange vigtige fordele i forhold til konventionelle PCR; Det har en hurtigere turn-around tid fra prøve til resultater og det kræver ikke nogen post-PCR trin. Dette sidste punkt betyder, at der er minimal risiko for laboratoriet forurening og det kan være mere let tilpasses til høj overførselshastighed situationer som i tilfælde af udbrud. Desuden er det i sagens natur mere følsomme end konventionelle RT-PCR, som er af afgørende betydning at opdage lave virale belastninger i subklinisk infektioner21. Dette ville kræve et indlejret PCR tilgang kræver reverse transkription, to yderligere PCR reaktioner og derefter analyse ved agarosegelelektroforese gel elektroforese. Disse mange trin tager en masse tid og øge chancerne for fejl eller forurening. Ikke desto mindre på grund af sin høje følsomhed kræver RT-qPCR omhyggelig eksperimentelle design og en grundig forståelse af kvantificering teknikker til at generere nøjagtige resultater56,57.
DNA bindende fluorophore, SYBR Green jeg har påvist i denne protokol. Det er en dsDNA uspecifik DNA bindende farvestof og dermed specificiteten af analysen ligger helt i sæt af primere, der kan generere falske positiver58. Derfor, mens dsDNA smeltende kurve analyse udført ved udgangen af hver PCR er en specielt vigtig del af PCR reaktion, fordi det bekræfter, at kun en PCR-amplikon af den korrekte Tm er produceret (dette bør opnås ved gel elektroforese når nye assays gennemføres). Thomsenm af et DNA-fragment er afhængig af en række forskellige funktioner som dens længde, GC sammensætning, sekvens, strand komplementaritet, koncentration såvel som på buffer komponenter og PCR smagsforstærkere. De smeltende kurve analyser i de repræsentative resultater vist fra to laboratorier ikke afsløre tilstedeværelsen af primer-dimerer eller andre uønskede PCR produkter, men hvis dette er observeret med andre prøver og/eller eksperimentelle set-ups, så analysen bør være re optimeret. Mere avancerede qPCR teknologier kræver ikke sådan en smeltende kurve trin og faktisk, siden denne metoder papir var skrevet, en TaqMan baseret TiLV RT-qPCR har udviklet udnytter to primere og en sonde, hvilket gør det yderst TiLV specifikke34.
Utvivlsomt, primere designet til RT-qPCR assays er grundlæggende for succes af analysen og primere her blev designet baseret på den offentligt tilgængelige TiLV genomisk data på tid32. Men RNA-vira er kendt at udstille høj mutation priser og mulige stammer vil slippe de nuværende diagnostiske test, som blev observeret for ISAV59. Det vil altid være vanskeligt for sådanne virustyper til at generere en universel pan-TiLV RT-qPCR analysen og disse analyser vil kun løbende forbedres, hvis flere TiLV genomisk data fra vidtrækkende placeringer og tidsperioder.
Endelig er det vigtigt at køre identiske eller om muligt eksemplarer reaktioner i både inden for og inter qPCR assays. Hvis Ct værdier er meget høj, så er brugen af flergangsbestemmelser især vigtigt at fastslå, at PCR reaktionen er pålidelig og reproducerbar. Generelt, hvis data fra replikerer reaktioner varierer mere end 0,5 cyklusser, reaktioner bør gentages og hvis Ct værdier konsekvent variere > 0,5 cyklusser i replikater, analysen bør optimeres igen. Anvendelse af en integreret qPCR pipettering robot hjælper utroligt med dette spørgsmål, men det er en luksus værktøj. Som med enhver eksperiment er den optagelse tilstrækkelige og passende kontrol af største vigtighed for udviklingen af robust molekylære assays, især i diagnostiske laboratorier, hvor disse analyser skal være akkrediteret. Kontrollen skal omfatte positive (positiv TiLV prøve, TiLV plasmid standard) og negative kontroller (NTC og -RT) prøver samt påvisning af endogene tilapia husholdning gener. Kontrollen kan ikke undervurderes, og bør indgå i hvert assay at korrekt forstå kvaliteten af hvert trin af analysen og korrekt fortolke resultaterne.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Institut for veterinær bakteriologi, Vetsuisse Fakultet, Berns universitet for deres støtte. Dette arbejde blev støttet af Udvalget for akademisk forfremmelse af tidlige karriere forskere og ligestilling mellem kønnene på det Vetsuisse Fakultet, Universitet af Bern af 120% model finansiering tildeles PN. WS og PR er støttet af Center for Advanced Studies for landbrug og fødevarer, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under videregående uddannelse forskning fremme og nationale forsknings Universitet projekt i Thailand, Office af videregående uddannelser Kommissionen, Undervisningsministeriet, Thailand. Vi vil gerne takke Dr. Kwanrawee Sirikanchana for hendes fortælling og Piyawatchara Sikarin til redigering af video.
Tissue collection | Step 1 | ||
Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative to clove oil. Step 1.1 |
RNAlater stabilization solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | For storing tissues if they cannot be processed immediately Step 1.3 |
RNA extraction | Step 2 | ||
TRIreagent | Sigma-Aldrich | Step 2.1 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 15596026 | Step 2.1 |
GENEzol | Geneaid | GZR100 | Step 2.1 |
Trisure | Bioline | BIO-38032 | Step 2.1 |
Homemade solution | - | - | 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 30.45 g/L (400 mM) ammonium thiocyanate 8.20 g/L (100 mM) sodium acetate 380 mL/L (38 % v/v) phenol 50 mL/L (5 % v/v) glycerol 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 Store up to 2 years at 4oC Step 2.1 |
MagNA Lyser Green Beads | Roche | 3358941001 | An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below Step 2.2 |
Lysing Matrix D, 2 mL Tube | MP BIOMEDICALS | 116913050 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Step 2.3 |
Chloroform | RCI Labscan | AR1027E-G2.5L | Step 2.3 |
1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B9673 | A less toxic alternative to chloroform Step 2.3 |
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % | Sigma-Aldrich | 59300 | Step 2.6 |
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.09634.2500 | Step 2.6 |
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) | Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) | R0551 | Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation optional |
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % | Sigma-Aldrich (EMD Millipore) | 1.00983 | Step 2.9 |
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck (EMSURE) | 1.00983.2500 | Step 2.9 |
Nuclease-free water | Promega | P1193 | Step 2.13 |
Nuclease-free water | Multicell | 809-115-CL | Step 2.13 |
Ambion TURBO DNA-free kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM1907 | Can be performed at the end of the RNA extraction protocol optional |
cDNA synthesis | Step 4 | ||
Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis | cDSK01 | Step 4.1 & 4.3 |
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover | Toyobo | A1172K | An alternative option see discussion |
ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | An alternative option see discussion |
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase | Agilent Technologies | 600107 | An alternative option |
PCR | Step 5 | ||
DNA polymerase systems: | Step 5.2 | ||
– Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 14001012a | Step 5.2 |
– GoTaq Mastermix | Promega | M7122 | Step 5.2 |
Separate PCR mixture components: | Step 5.2 | ||
10mM dNTP Mix | Vivantis | NP2409 | Step 5.2 |
25mM MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | R0971 | Step 5.2 |
10X Taq Buffer with KCl | Thermo Fisher Scientific | 00348114 | Step 5.2 |
Taq DNA polymerase | Vivantis | PL1202 | Step 5.2 |
– Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq | Thermo Fisher Scientific | AB1454 | One step RT-PCR exemplified in Figure 3B |
Gel electrophoresis: | For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4 | ||
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 17898 | Step 5.5 |
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: | Step 5.5 | ||
– Tris | Vivantis | PR0612-1KG | Step 5.5 |
– Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.00063.2500 | Step 5.5 |
– Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BIO-RAD | 161-0729 | Step 5.5 |
Agarose | Vivantis | PC0701-100G | Step 5.5 |
DNA ladders and markers | Vivantis | NL1405 | Step 5.5 |
DNA gel loading dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Step 5.5 |
qPCR | Step 6 | ||
PowerUP SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | A25779 | Exemplified in Figures4-6B Step 6.2 |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1725120 | Exemplified in the video and in Figures 4-6A Step 6.2 |
Equipment | |||
Dounce tissue grinder pestle | Sigma-Aldrich | P1110 | Protocol 2 |
MagNA Lyser Instrument | Roche | 3358976001 | An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above Step 2.2 |
FastPrep-24 5G Homogenizer | MP BIOMEDICALS | 116005500 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5427R | Protocol 2 Step 2.4, 2.7 & 2.10 |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5418R | |
Heat box | Labnet | AccuBlock Digital Dry Bath | Protocol 2 Step 2.13 |
Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | Nanodrop 2000 | Protocol 3 Step 3.1 – 3.4 |
PCR machine | BIO-RAD | T100 Thermal Cycler | Protocol 5 Step 5.4 |
Power supply | BIO-RAD | PowerPac HC | Protocol 5 Step 5.5 |
Horizontal gel electrophoresis | BIO-RAD | Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu | Protocol 5 Step 5.5 |
Mini microcentrifuge | Corning | LSE 6766 | Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6 Step 6.5.1 |
Microcentrifuge | LioFuge | LM-60 | Step 6.5.1 |
qPCR machine and software | Thermo Fisher Scientific | 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 | Protocol 6 Step 6.6-6.8 |
qPCR machine and software | BIO-RAD | CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software | |
General Materials | |||
Mayo scissors | Step 1.1-1.2 | ||
Forceps | Step 1.1-1.2 | ||
Pipette | Rainin | Pipette-Lite XLS | |
Aerosol-barrier pipette tips | Sigma-Aldrich | Z333328, Z333336, Z333344 | |
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf |