यह प्रोटोकॉल आरटी-पीसीआर के तरीके का उपयोग करके Tilapia ऊतकों में Tilapia लेक वायरस (TiLV) का निदान करते हैं । पूरे विधि ऊतक विच्छेदन से कुल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण और या तो पारंपरिक पीसीआर या मात्रात्मक पीसीआर dsDNA एक फ्लोरोसेंट बाध्यकारी डाई बाध्यकारी का उपयोग करके TiLV का पता लगाने के बाद से वर्णित है ।
इस विधि का उद्देश्य Tilapia ऊतकों में Tilapia लेक वायरस (TiLV) के तेज, संवेदनशील और विशिष्ट पता लगाने की सुविधा है । इस प्रोटोकॉल निगरानी कार्यक्रमों के भाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, सुरक्षा उपायों और TiLV बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में । वायरस निदान के स्वर्ण मानक आमतौर पर आगे सत्यापन के लिए रिवर्स-प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) के रूप में पूरक तकनीक के बाद वायरस अलगाव शामिल है । यह बोझिल हो सकता है, समय लेने वाली और आम तौर पर ऊतक भारी वायरस से संक्रमित नमूनों की आवश्यकता है । आर टी-मात्रात्मक (क्यू) वायरस का पता लगाने में पीसीआर के उपयोग के कारण अपने मात्रात्मक प्रकृति, उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता, दरिद्रता और इसकी तेजी से समय परिणाम के लिए लाभप्रद है । यहां, TiLV पता लगाने के लिए पीसीआर आधारित दृष्टिकोण की पूरी विधि वर्णित है, tilapia अंग से खोदी, कुल ribonucleic एसिड (आरएनए) निष्कर्षण एक guanidium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म समाधान का उपयोग कर, आरएनए ठहराव, एक दो कदम पीसीआर द्वारा पीछा किया प्रोटोकॉल जरूरत पर जोर, पूरक deoxyribonucleic एसिड (सीडीएनए) संश्लेषण और TiLV का पता लगाने के द्वारा या तो पारंपरिक पीसीआर या मात्रात्मक पहचान SYBR ग्रीन मैं डाई का उपयोग qPCR के माध्यम से. पारंपरिक पीसीआर के बाद पीसीआर कदम की आवश्यकता है और बस वायरस की उपस्थिति के बारे में सूचित करेंगे । उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण TiLV के निरपेक्ष ठहराव के लिए नीचे के रूप में छोटे रूप में 2 प्रतियां और इस प्रकार उप में TiLV निदान के लिए असाधारण उपयोगी है नैदानिक मामलों की अनुमति होगी । दो पीसीआर दृष्टिकोण का एक विस्तृत विवरण, दो प्रयोगशालाओं से प्रतिनिधि परिणाम और दोनों के महत्वपूर्ण मापदंडों की एक गहन चर्चा यह सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया गया है कि शोधकर्ताओं और diagnosticians खोजने के लिए उनके सबसे उपयुक्त और लागू TiLV का पता लगाने की विधि ।
वैश्विक व्यक्ति मछली आपूर्ति २०१४ में 20 किलो के एक नए रिकॉर्ड पर पहुंच गया और यह जलीय कृषि में जोरदार वृद्धि के कारण था । जलीय कृषि दुनिया भर में सबसे तेजी से बढ़ती पशु खाद्य क्षेत्रों में से एक है और केवल पशु खाद्य क्षेत्र है कि तेजी से मानव आबादी1से बढ़ रहा है उत्पादन है । Tilapiine cichilds दूसरे सबसे महत्वपूर्ण ताजा पानी की मछली ६,४००,००० टन (मीट्रिक टन) और २०१५2में ९,८००,०००,००० अमेरिकी डॉलर का अनुमानित मूल्य के कुल वैश्विक उत्पादन के साथ दुनिया भर में कृषि शामिल हैं । tilapia के शीर्ष दस उत्पादकों चीन (१.७८ मीट्रिक टन), इंडोनेशिया (१.१२ मीट्रिक टन) और मिस्र (०.८८ मीट्रिक टन), बांग्लादेश, वियतनाम, फिलीपींस, ब्राजील, थाईलैंड, कोलंबिया और युगांडा2द्वारा पीछा कर रहे हैं । उम्मीद की जा रही है कि वैश्विक tilapia उत्पादन २०३०3से करीब ७.३ मीट्रिक टन होगा । Tilapia इस तरह के एक महत्वपूर्ण वैश्विक खाद्य स्रोत बन गए है न केवल क्योंकि वे4 प्रोटीन का एक सस्ता स्रोत हैं, लेकिन यह भी है क्योंकि वे पानी और जलवायु की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत क्षमता में नस्ल के लिए आसान कर रहे है5,6। अभी कुछ दशक पहले, यह माना जाता था कि वहां कुछ व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण tilapia खेती की धमकी बीमारियों थे, लेकिन यह अब सच है । tilapia लेक वायरस रोग (TiLVD) नामक एक उभरती हुई वायरल बीमारी tilapia में पाई जाने वाली पहली गंभीर बीमारी महामारी है और संपूर्ण उद्योग खतरे में है । इस बीमारी के गंभीर सामाजिक-आर्थिक परिणाम हैं और अफ्रीका के7, एशिया और दक्षिण अमेरिका में लाखों लोगों के लिए खाद्य सुरक्षा पर सीधा खतरा है । २०१८ के शुरू में, विश्व पशु स्वास्थ्य (OIE) के लिए संगठन की रिपोर्ट है कि इस रोग के etiological एजेंट, TiLV, आधिकारिक तौर पर आठ8 देशों को कवर तीन महाद्वीपों पर पाया गया था और के बाद से इस रोगज़नक़ जानकारी कार्ड था वहां अद्यतन तंजानिया, युगांडा9, इंडोनेशिया10, ताइवान11 और पेरू12में TiLV की अधिक रिपोर्ट किया गया है । TiLV एक उपंयास एकल कतरा आरएनए वायरस एक orthomyxo वायरस की तरह होने का वर्णन किया है, क्योंकि यह अंय orthomyoxoviruses जैसे इंफ्लूएंजा या संक्रामक सामन रक्ताल्पता वायरस (इससव)13के रूप में याद ताजा विशेषताओं की एक किस्म शामिल है । यह पहले गलील, इसराइल14की झील में जंगली और farmed tilapia के बड़े पैमाने पर नुकसान के बाद में पहचाना गया था । इसके बाद, इसी तरह के रोग के प्रकोप को ग्रीष्मकालीन मृत्यु के रूप में संदर्भित किया जाता है और एक महीने TiLV संक्रमण से जुड़े मृत्यु दर सिंड्रोम15 और नील नदी और लाल संकर tilapia में नील नदी में tilapia (Oreochromis niloticus) में सूचना दी गई (Oreochromis एसपीपी.) थाईलैंड में16, क्रमशः । जलीय पशु वायरसों का पता लगाना ऐतिहासिक रूप से कोशिका संस्कृति में विकास और वायरस के अलगाव द्वारा किया जाता है । विभिंन सेल लाइनों के प्रचार और अलगाव सहित TiLV के लिए परीक्षण किया गया है, ई-11 snakehead मछली से व्युत्पंन कोशिकाओं (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB और TmB से मूल Oreochromis mossambicus18, और OnlB और OnlL से उद्भव नील tilapia (ओ. niloticus)19. जबकि वायरस संस्कृति लाभ है कि यह आगे प्रयोगों के लिए सामग्री प्रदान करता है, यह नुकसान है कि यह कम से 4-7 दिनों की आवश्यकता है cytopathic प्रभाव (सीपीई) के गठन का पालन करने के लिए और महत्वपूर्ण, अलग piscine वायरस, कि और अधिक फिट करने के लिए कर रहे हैं दोहराने प्रचारित किया जा सकता है और इसी तरह सीपीई उत्पादन ।
पिछले कुछ दशकों में, वहां एक कदम पारंपरिक से दूर किया गया है, अक्सर ऐसे सेल संस्कृति, सीरोलॉजी और प्रतिजन का पता लगाने और तेजी से और अधिक संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड आधारित डिटेक्शन परीक्षण के साथ प्रतिस्थापन के रूप में समय लेने वाली नैदानिक तरीकों20, 21. शी. इस तथ्य से स्पष्ट है कि कई qPCR परख जैसे जलीय पशुओं में वायरल रोगों की एक भीड़ के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक तरीकों के रूप में विकसित किया गया है, जैसे इससव के लिए22,23, वायरल गलघोंटू सेप्टीसीमिया वायरस (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 salmonid alphavirus28, मछली iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30, और Lymphocystis रोग विषाणु (LCDV)31 . निदान और रोगज़नक़ निगरानी के लिए मजबूत तरीके तत्काल TiLV के प्रसार को कम करने के लिए आवश्यक हैं । इस तरह के तरीकों नैदानिक संकेत विकसित करने और कम वायरस के भार का पता लगाने से पहले संक्रमण का जल्दी पता लगाने की अनुमति चाहिए । तारीख करने के लिए, आर टी-पीसीआर14,३२, नेस्टेड आरटी-पीसीआर18, अर्द्ध नेस्टेड आरटी-पीसीआर३३, और आरटी-qPCR३२,३४ सहित अलग पीसीआर प्रोटोकॉल TiLV का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है मछली के ऊतकों में । rt-qPCR और TiLV डिटेक्शन के लिए अतिसंवेदनशील कक्ष पंक्तियों में वायरस अलगाव की तुलना पता चला कि rt-qPCR १,००० बार वायरस अलगाव३२से अधिक संवेदनशील था । हालांकि प्रत्येक प्रकाशित पीसीआर प्रोटोकॉल TiLV का पता लगाने के लिए अलग संवेदनशीलता की सूचना दी है, ज्यादातर परख वायरल प्रतियां की पहचान सीमा के साथ अति संवेदनशील ७.५ प्रतियां३३, 7 प्रतियां18 या 2 प्रतियां३२ प्रति प्रतिक्रिया.
इस विधि लेख के उद्देश्य को समझाने के लिए है, विस्तार में, कैसे TiLV जांच परख प्रदर्शन करने के लिए, tilapia ऊतक संग्रह के साथ शुरू, कुल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण और फिर TiLV विशिष्ट पीसीआर आधारित परख । विशेष रूप से, दोनों पारंपरिक rt-पीसीआर और भी SYBR ग्रीन आधारित आरटी-qPCR के व्यापक प्रोटोकॉल के लिए TiLV का पता लगाने के लक्ष्य वैज्ञानिकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अपील करने के लिए वर्णित किया गया है । पूर्व कम संवेदनशील है, लेकिन आम तौर पर एक सस्ता खोज विकल्प है । बाद में एक मात्रात्मक पीसीआर मशीन और अधिक महंगा रिएजेंट के रूप में और अधिक विस्तृत बुनियादी ढांचे की आवश्यकता है, लेकिन यह मात्रात्मक, तेजी से और अति संवेदनशील होने का लाभ है, जिसका अर्थ है कि यह उप में TiLV का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चिकित्सकीय संक्रमित मछली । आर टी-पीसीआर और आरटी-qPCR प्रोटोकॉल अलग भौगोलिक TiLV के अलग और शामिल परिणामों के साथ दो विभिंन प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया गया संवेदनशीलता और यहां वर्णित परख की reproducibility पर प्रकाश डाला ।
TiLV पहले इसराइल14 में २०१४ में बताया गया था और तब से, यह मिस्र, कोलंबिया, भारत, मलेशिया, युगांडा, तंजानिया और थाईलैंड सहित कई देशों में पहचान की गई है15,16,18, ३५ , ४८. वैश्विक जागरूकता, विशेष रूप से, tilapia उत्पादक देशों में वायरस पर अधिक ध्यान रखा गया है और सरकारी अधिकारियों से विभिन्न प्रतिबंधों और नियंत्रण उपायों को TiLV के प्रसार को रोकने के प्रयास को लागू किया गया है. यहां, tilapia ऊतक में TiLV का पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, नमूना संग्रह को कवर, आरएनए अलगाव, सीडीएनए संश्लेषण, पीसीआर और qPCR परख समझाया गया है । इन तरीकों कि विशेष चर्चा वारंट के लिए विभिंन पहलुओं रहे हैं । TiLV कीपहचान की गई है मछली में फैले एक किस्म के आकार9,12,14,15,४९ और tilapia की प्रजातियों अब तक, farmed संकर tilapia सहित (हे । niloticus x ओ. aureus)11,14, नील tilapia (ओ. niloticus)9,10,14,15,16, ३३ , ३५ , ३६ , ४९ , ५० और लाल tilapia (Oreochromis sp.)16,३३,४८,५१, साथ ही जंगली नील नदी में tilapia9,12, काला tilapia५१, zilli14,15, एस. galilaeus, ओ. aureus और टी. simonis मीडिया14 और बहुत हाल ही में TiLV जंगली कार्प में पहचान की गई थी (Barbonymus schwanenfeldii)५२. आंतरिक अंगों से ऊतक के नमूनों (गिल, तिल्ली, जिगर, दिल, सिर गुर्दे) या बलगम३७ स्वस्थ से एकत्र किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से उम्र, आकार या प्रजातियों की परवाह किए बिना मरणासन्न tilapia और आरएनए अलगाव के लिए कार्रवाई की । यहाँ उल्लिखित कुल आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल phenol और guanidinium thiocyanate के एक monophasic समाधान का उपयोग करता है, जो एक chaotropic denaturing एजेंट है । ऊतकों को इस समाधान में सीधे homogenized है क्लोरोफॉर्म और केंद्रापसारक के अलावा चरण जुदाई को प्राप्त करने के लिए जिसमें एक स्पष्ट ऊपरी जलीय चरण युक्त आरएनए, एक चरण और एक कम कार्बनिक चरण उत्पंन होता है । आरएनए isopropanol वर्षा से जलीय चरण से पृथक है, बरामद आरएनए की धुलाई के बाद दूषित पदार्थों से छुटकारा पाने के लिए. इस पद्धति द्वारा आरएनए के अलगाव Piotr Chomczynski और Nicoletta Sacchi द्वारा उठाया गया था और guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण५३,५४के रूप में भेजा गया था । आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया एजेंट के इस प्रकार व्यावसायिक रूप से खरीदा या प्रयोगशाला में किया जा सकता है (अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें). यह प्रोटोकॉल सिलिका आधारित शुद्धि जैसे स्तंभ-आधारित पद्धतियों से थोड़ा अधिक समय लेता है, लेकिन सामान्य तौर पर यह अधिक लागत प्रभावी होती है और अधिक आरएनए की पैदावार होती है ।
इस प्रोटोकॉल में, A260 मूल्यों का उपयोग करते हुए आरएनए को रेखांकित किया गया था जिससे spectrophotometry मान आरएनए गुणवत्ता का संकेत कर सकते हैं (A260/A280 = १.९-२.१). हालांकि इस विधि नमूना शुद्धता का एक अच्छा संकेत दे देंगे, यह पूरी तरह से निकाली आरएनए की गुणवत्ता के बारे में सूचित नहीं कर सकते. शाही सेना बरकरार है या आंशिक रूप से नीचा है कि ठीक से निर्धारित करने के लिए, नमूनों agarose जेल ट्रो द्वारा जुदाई हो सकता है जिसमें EtBr दाग 18S और 28S rRNA बैंड के धब्बा आरएनए क्षरण का संकेत मिलता है । आरएनए गुणवत्ता के आगे सत्यापन एक प्रयोगशाला पर एक चिप साधन का उपयोग कर शामिल हो सकते हैं. इसके अलावा, यह भी DNase मैं दूषित मेजबान जीनोमिक डीएनए है, जो बहाव अनुप्रयोगों के आधार पर झूठी परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते है हटाने के लिए के साथ शुद्ध आरएनए पचाने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि मेजबान gDNA अभी भी एक बड़ी हद तक आरएनए नमूना दूषित है, एक अतिरिक्त DNaseI उपचार भी आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के अंत में किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
पूरक डीएनए संश्लेषण बहुत समग्र qPCR परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं और इस विधि का एक पहलू है कि भिन्नता का परिचय कर सकते हैं. सीडीएनए प्रोटोकॉल की वकालत की यहां एक घटक सेट अप oligo (डीटी) का उपयोग कर के शामिल है और इस तरह केवल टाइप polyA पूंछ युक्त mRNAs । यह वास्तव में जो घटक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में उपयोग करने के लिए और सीडीएनए संश्लेषण की इस विधा के उपयोगकर्ता नियंत्रण की अनुमति देता है TiLV का पता लगाने३२के लिए सफल साबित कर दिया । इस सेट अप के लिए एक विकल्प एक व्यावसायिक रूप से खरीदा मास्टर-रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सभी घटकों से युक्त मिश्रण है और बहुत तेजी से और सरल बिना सामांय बहु कदम, pipetting और बहु तापमान प्रोटोकॉल है । यह लाभप्रद है क्योंकि यह हैंडलिंग को कम करता है और सभी नमूनों में एकरूपता को बढ़ावा देता है । इस तरह के मास्टर घोला जा सकता है अक्सर दोनों oligo (डीटी) और यादृच्छिक प्राइमर यह अलग आरएनए टेम्पलेट्स के लिए लागू है और एक आबादी में RNAs की पूरी लंबाई से अनुक्रम के प्रतिनिधि सीडीएनए प्रतियां सृजन (वायरल और tilapia मेजबान mRNA) और सिद्धांत में शामिल हैं, हर वांछित आरएनए प्रजातियों फिर इस तरह के एक नमूने से पारंपरिक पीसीआर या qPCR द्वारा मापा जा सकता है । इस बहुमुखी प्रतिभा के एक 2 कदम आरटी-पीसीआर दृष्टिकोण का मुख्य लाभ है; यह एक दीर्घकालिक पूल है कि कई विभिंन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदान करता है । परिणामों में, एक कदम आरटी-पीसीआर दृष्टिकोण प्रतिनिधित्व किया गया है जिसमें अनुक्रम विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग किया गया और आर टी और पीसीआर एक ट्यूब में प्रदर्शन किया गया (सामग्री सूची देखें) । सामांय में, अनुक्रम विशिष्ट प्राइमर यादृच्छिक भड़काना का उपयोग कर से विशिष्ट लक्ष्य आरएनए की एक उच्च आरटी दक्षता के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन विशिष्ट लक्ष्य आरएनए केवल एक ही है कि इस तरह के एक सीडीएनए नमूना है जो कुछ प्रयोगशालाओं का ही उद्देश्य हो सकता है में quantified जा सकता है (देखें सीडीएनए संश्लेषण उत्पाद सुझावों के लिए सामग्री की तालिका).
जबकि पारंपरिक आरटी-पीसीआर आमतौर पर अब तक TiLV निदान9,13,14,15,16,17,18 में इस्तेमाल किया प्रतीत होता है, ३३ , ३५ , ४८ , ५५. RT-qPCR का पता लगाने और मछली के ऊतकों या बलगम३२,३७में TiLV की छोटी मात्रा के ठहराव के लिए एक अधिक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए दिखाया गया है. सामांय में, qPCR व्यापक रूप से अपने उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता, अच्छा reproducibility, व्यापक गतिशील रेंज और21गति के कारण नैदानिक वायरोलॉजी नैदानिक प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है । जबकि qPCR शुरू में और अधिक पारंपरिक आरटी-पीसीआर से लागू करने के लिए महंगा हो सकता है, यह पारंपरिक पीसीआर पर कई महत्वपूर्ण लाभ की पेशकश करता है; यह नमूना से परिणाम के लिए समय के आसपास एक तेजी से बारी है और यह किसी के बाद पीसीआर कदम की आवश्यकता नहीं है । यह बाद बिंदु का मतलब है कि वहां प्रयोगशाला संदूषण के लिए ंयूनतम जोखिम है और यह अधिक आसानी से उच्च प्रवाह स्थितियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसे फैलने की स्थिति में । इसके अलावा, यह स्वाभाविक आर टी पीसीआर, जो महत्वपूर्ण महत्व का है उप नैदानिक संक्रमण21में कम वायरल भार का पता लगाने की तुलना में अधिक संवेदनशील है । यह एक नेस्टेड पीसीआर रिवर्स प्रतिलेखन, दो और पीसीआर प्रतिक्रियाओं और फिर agarose जेल ट्रो द्वारा विश्लेषण की आवश्यकता होती दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी । ये कई कदम समय की एक बहुत ले और त्रुटियों या दूषित होने की संभावना बढ़ जाती है । बहरहाल, इसके उच्च संवेदनशीलता के कारण, आर टी-qPCR मांग सावधानीपूर्वक प्रयोगात्मक डिजाइन और सटीक परिणाम५६,५७पैदा करने के लिए ठहराव तकनीकों की एक पूरी तरह से समझ ।
डीएनए बाइंडिंग fluorophore, SYBR ग्रीन मैं इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया गया है । यह एक dsDNA विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी डाई और इस तरह परख की विशिष्टता है प्राइमरों के सेट में पूरी तरह से झूठ है, जो झूठी सकारात्मक५८उत्पंन कर सकते हैं । इसलिए, जबकि dsDNA पिघलने वक्र विश्लेषण प्रत्येक पीसीआर के अंत में प्रदर्शन किया पीसीआर प्रतिक्रिया का एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण हिस्सा है क्योंकि यह पुष्टि करता है कि सही टीएम की केवल एक पीसीआर amplicon का उत्पादन किया है (यह भी जेल से प्राप्त होना चाहिए ट्रो जब नई परख लागू किया जा रहा है) । एक डीएनए टुकड़ा की टीएम अपनी लंबाई, जीसी संरचना, अनुक्रम, किनारा complementarity, एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बफर घटकों और पीसीआर बढ़ाने पर जैसे सुविधाओं की एक किस्म पर निर्भर है । दो प्रयोगशालाओं से दर्शाए गए प्रतिनिधि परिणामों में पिघलते वक्र विश्लेषणों में प्राइमरी-dimers या अन्य अवांछित पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति का खुलासा नहीं हुआ था, लेकिन यदि यह अन्य नमूनों और/या प्रयोगात्मक सेट-अप के साथ मनाया जाता है, तो परख होनी चाहिए पुनः अनुकूलित । और अधिक उंनत qPCR प्रौद्योगिकियों इस तरह के एक पिघलने वक्र कदम की आवश्यकता नहीं है और वास्तव में, के बाद से इस तरीके कागज, लिखा था एक TaqMan आधारित TiLV आरटी-qPCR दो प्राइमरों और एक जांच यह उच्च TiLV विशिष्ट३४बनाने का उपयोग विकसित किया गया है ।
निस्संदेह, आरटी के लिए डिजाइन प्राइमरों-qPCR परख परख की सफलता के लिए मौलिक है और यहां प्राइमरों३२समय में सार्वजनिक रूप से उपलब्ध TiLV जीनोमिक डेटा पर आधारित डिजाइन किए गए थे । हालांकि, आरएनए वायरस इससव५९के लिए मनाया गया था, के रूप में उच्च उत्परिवर्तन दरों और संभावित उपभेदों वर्तमान नैदानिक परीक्षणों से बच जाएगा प्रदर्शन करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है । यह हमेशा के लिए इस तरह के वायरस के प्रकार के लिए मुश्किल हो जाएगा एक सार्वभौमिक पैन-TiLV RT-qPCR परख और ऐसे परख केवल लगातार सुधार होगा अगर अधिक TiLV से जीनोमिक डेटा तक पहुंचने स्थानों और समय अवधि उपलब्ध हो उत्पंन करने के लिए ।
अंत में, यह डुप्लिकेट या यदि संभव हो तो चलाने के लिए आवश्यक है, दोनों इंट्रा और अंतर qPCR परख में तपसिल प्रतिक्रियाओं । यदि Ct मान बहुत अधिक है, तो प्रतिकृति का उपयोग विशेष रूप से पता लगाने के लिए कि पीसीआर प्रतिक्रिया विश्वसनीय और reproducible है महत्वपूर्ण है । सामान्य तौर पर, यदि दोहराने प्रतिक्रियाओं से डेटा ०.५ चक्र से अधिक भिन्न होता है, प्रतिक्रियाओं दोहराया जाना चाहिए और सीटी मूल्यों लगातार भिन्न होता है > ०.५ चक्रों में प्रतिकृति, परख फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए. एक एकीकृत qPCR pipetting रोबोट का उपयोग इस मुद्दे के साथ बेहद मदद करता है, लेकिन यह एक लक्जरी उपकरण है । किसी भी प्रयोग के साथ के रूप में, समावेश पर्याप्त और उचित नियंत्रण मजबूत आणविक परख के विकास के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैं, विशेष रूप से नैदानिक प्रयोगशालाओं में जहां ऐसे परख के लिए मांयता प्राप्त है । नियंत्रण सकारात्मक (सकारात्मक TiLV नमूना, TiLV प्लाज्मिड मानक) और नकारात्मक नियंत्रण (एनटीसी और आरटी) नमूने के रूप में अच्छी तरह से अंतर्जात tilapia गृह व्यवस्था जीन का पता लगाने के रूप में शामिल करना चाहिए । इस तरह के नियंत्रण को कम करके आंका नहीं जा सकता है और प्रत्येक परख में शामिल किया जाना चाहिए ठीक से परख के हर कदम की गुणवत्ता को समझने के लिए और ठीक से परिणाम की व्याख्या ।
The authors have nothing to disclose.
हम उनके समर्थन के लिए पशु चिकित्सा वैक्टीरिया, Vetsuisse संकाय, बर्न विश्वविद्यालय के संस्थान के लिए आभारी हैं । इस काम के Vetsuisse संकाय में जल्दी कैरियर शोधकर्ताओं और लैंगिक समानता के अकादमिक संवर्धन के लिए समिति द्वारा वित्त पोषित किया गया, १२०% मॉडल अनुदान द्वारा बर्न के विश्वविद्यालय PN को संमानित किया । WS और पीआर कृषि और खाद्य के लिए उंनत अध्ययन के लिए केंद्र द्वारा समर्थित हैं, उंनत अध्ययन के लिए संस्थान, Kasetsart विश्वविद्यालय, बैंकॉक, उच्च शिक्षा अनुसंधान संवर्धन और थाईलैंड के राष्ट्रीय अनुसंधान विश्वविद्यालय परियोजना के तहत थाईलैंड, कार्यालय उच् च शिक्षा आयोग, शिक्षा मंत्रालय, थाइलैंड । हम वीडियो संपादन के लिए उसके कथन और Piyawatchara Sikarin के लिए Dr. Kwanrawee Sirikanchana शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Tissue collection | Step 1 | ||
Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative to clove oil. Step 1.1 |
RNAlater stabilization solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | For storing tissues if they cannot be processed immediately Step 1.3 |
RNA extraction | Step 2 | ||
TRIreagent | Sigma-Aldrich | Step 2.1 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 15596026 | Step 2.1 |
GENEzol | Geneaid | GZR100 | Step 2.1 |
Trisure | Bioline | BIO-38032 | Step 2.1 |
Homemade solution | - | - | 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 30.45 g/L (400 mM) ammonium thiocyanate 8.20 g/L (100 mM) sodium acetate 380 mL/L (38 % v/v) phenol 50 mL/L (5 % v/v) glycerol 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 Store up to 2 years at 4oC Step 2.1 |
MagNA Lyser Green Beads | Roche | 3358941001 | An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below Step 2.2 |
Lysing Matrix D, 2 mL Tube | MP BIOMEDICALS | 116913050 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Step 2.3 |
Chloroform | RCI Labscan | AR1027E-G2.5L | Step 2.3 |
1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B9673 | A less toxic alternative to chloroform Step 2.3 |
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % | Sigma-Aldrich | 59300 | Step 2.6 |
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.09634.2500 | Step 2.6 |
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) | Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) | R0551 | Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation optional |
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % | Sigma-Aldrich (EMD Millipore) | 1.00983 | Step 2.9 |
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck (EMSURE) | 1.00983.2500 | Step 2.9 |
Nuclease-free water | Promega | P1193 | Step 2.13 |
Nuclease-free water | Multicell | 809-115-CL | Step 2.13 |
Ambion TURBO DNA-free kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM1907 | Can be performed at the end of the RNA extraction protocol optional |
cDNA synthesis | Step 4 | ||
Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis | cDSK01 | Step 4.1 & 4.3 |
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover | Toyobo | A1172K | An alternative option see discussion |
ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | An alternative option see discussion |
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase | Agilent Technologies | 600107 | An alternative option |
PCR | Step 5 | ||
DNA polymerase systems: | Step 5.2 | ||
– Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 14001012a | Step 5.2 |
– GoTaq Mastermix | Promega | M7122 | Step 5.2 |
Separate PCR mixture components: | Step 5.2 | ||
10mM dNTP Mix | Vivantis | NP2409 | Step 5.2 |
25mM MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | R0971 | Step 5.2 |
10X Taq Buffer with KCl | Thermo Fisher Scientific | 00348114 | Step 5.2 |
Taq DNA polymerase | Vivantis | PL1202 | Step 5.2 |
– Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq | Thermo Fisher Scientific | AB1454 | One step RT-PCR exemplified in Figure 3B |
Gel electrophoresis: | For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4 | ||
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 17898 | Step 5.5 |
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: | Step 5.5 | ||
– Tris | Vivantis | PR0612-1KG | Step 5.5 |
– Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.00063.2500 | Step 5.5 |
– Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BIO-RAD | 161-0729 | Step 5.5 |
Agarose | Vivantis | PC0701-100G | Step 5.5 |
DNA ladders and markers | Vivantis | NL1405 | Step 5.5 |
DNA gel loading dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Step 5.5 |
qPCR | Step 6 | ||
PowerUP SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | A25779 | Exemplified in Figures4-6B Step 6.2 |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1725120 | Exemplified in the video and in Figures 4-6A Step 6.2 |
Equipment | |||
Dounce tissue grinder pestle | Sigma-Aldrich | P1110 | Protocol 2 |
MagNA Lyser Instrument | Roche | 3358976001 | An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above Step 2.2 |
FastPrep-24 5G Homogenizer | MP BIOMEDICALS | 116005500 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5427R | Protocol 2 Step 2.4, 2.7 & 2.10 |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5418R | |
Heat box | Labnet | AccuBlock Digital Dry Bath | Protocol 2 Step 2.13 |
Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | Nanodrop 2000 | Protocol 3 Step 3.1 – 3.4 |
PCR machine | BIO-RAD | T100 Thermal Cycler | Protocol 5 Step 5.4 |
Power supply | BIO-RAD | PowerPac HC | Protocol 5 Step 5.5 |
Horizontal gel electrophoresis | BIO-RAD | Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu | Protocol 5 Step 5.5 |
Mini microcentrifuge | Corning | LSE 6766 | Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6 Step 6.5.1 |
Microcentrifuge | LioFuge | LM-60 | Step 6.5.1 |
qPCR machine and software | Thermo Fisher Scientific | 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 | Protocol 6 Step 6.6-6.8 |
qPCR machine and software | BIO-RAD | CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software | |
General Materials | |||
Mayo scissors | Step 1.1-1.2 | ||
Forceps | Step 1.1-1.2 | ||
Pipette | Rainin | Pipette-Lite XLS | |
Aerosol-barrier pipette tips | Sigma-Aldrich | Z333328, Z333336, Z333344 | |
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf |