Repressione della crescita delle cellule di mieloma multiplo In Vivo di nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT)-consegnato oligo antisenso MALAT1
Summary
Questo manoscritto descrive la sintesi di un nanotubo di carbonio a parete singola (SWCNT)-coniugato MALAT1 gapmer antisenso del DNA oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), che dimostra la consegna affidabile del SWCNT e il potente effetto terapeutico di anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Metodi utilizzati per la sintesi, la modifica, la coniugazione e iniezione di SWCNT-anti-MALAT1 sono descritti.
Abstract
I nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT) sono un nuovo tipo di nanoparticelle, che sono stato utilizzato per fornire più tipi di farmaci nelle cellule, come proteine, oligonucleotidi e droghe sintetiche della piccolo-molecola. Il SWCNT ha dimensioni personalizzabili, un’ampia area superficiale e non può vincolare in modo flessibile con farmaci attraverso diverse modifiche sulla sua superficie; Pertanto, è un sistema ideale per il trasporto di farmaci nelle cellule. RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) è un cluster di RNA non codificante più di 200 nt, che non può essere tradotto in proteina, ma svolgono un ruolo importante nei processi biologici e fisiopatologici. Trascrizione di adenocarcinoma polmonare metastasi-collegata 1 (MALAT1) è un lncRNA altamente conservata. È stato dimostrato che i livelli elevati di MALAT1 sono relazionati con la prognosi difficile di vari cancri, compreso il mieloma multiplo (MM). Abbiamo rivelato che MALAT1 regola la morte delle cellule e la riparazione del DNA in MM; così, MALAT1 può essere considerato come un obiettivo terapeutico per MM. Tuttavia, la consegna efficiente dell’oligo antisenso per inibire/atterramento MALAT1 in vivo è ancora un problema. In questo studio, abbiamo modificare il SWCNT con PEG-2000 e coniugato un oligo di anti-MALAT1 ad esso, testare la consegna di questo composto in vitro, iniettare per via endovenosa un modello di topo MM diffuso e osservare un’inibizione significativa di progressione di MM, che indica tale SWCNT è una navetta di consegna ideale per gapmer anti-MALAT1 del DNA.
Introduction
Il SWCNT è un nanomateriale romanzo in grado di fornire vari tipi di droghe, come acidi nucleici, proteine e piccole molecole stabile ed efficiente con ideale tollerabilità e minima tossicità in vitro1 e vivo in2. Un SWCNT funzionalizzati ha solubilità ottima biocompatibilità e acqua, può essere utilizzato come un servizio di navetta per molecole più piccole e può portarli per penetrare la membrana cellulare3,4,5.
lncRNAs sono un cluster di RNA (> 200 nt) che sono trascritti dal genoma al mRNA ma non può essere tradotto in proteine. La prova aumentante ha dimostrato che lncRNAs partecipano alla regolazione dell’ espressione di gene6 e sono coinvolti nell’iniziazione e progressione della maggior parte dei tipi di cancro, tra cui MM7,8,9. MALAT1 è una trascrizione nucleare arricchito non codificante, 2 (NEAT2) e un lncRNA altamente conservato10. MALAT1 è inizialmente riconosciuto in metastatico del polmone non a piccole cellule (NSCLC) cancro11, ma ha stato sovraespresso in numerosi tumori5,12,13; è uno della più altamente espressi lncRNAs ed è correlata con una prognosi difficile in MM8,14. Il livello di espressione di MALAT1 è significativamente più alto in pazienti con MM extramedullary corso mortale rispetto a quelli diagnosticati solo come MM15.
In uno studio precedente, abbiamo confermato che anti-MALAT1 oligos robustamente portare a danni al DNA e l’apoptosi in MM16 utilizzando oligonucleotidi antisenso di DNA gapmer MALAT1 di targeting (anti-MALAT1) in cellule di MM. Il DNA di gapmer è composto di DNA antisenso e collegato da 2′-OMe-RNA, che ha potuto richiamare MALAT1 fenditura da RNasi H attività una volta legato17. L’efficienza di consegna in vivo di oligo antisenso ancora limita il suo uso clinico.
Per verificare la consegna effetto di SWCNT per anti-MALAT1 gapmer i oligos, l’anti-MALAT1 gapmer DNA è coniugato a DSPE-PEG2000-ammina funzionalizzati SWCNT. SWCNT-anti-MALAT1 allora è iniettato per via endovenosa in un modello di topo diffusa MM; un’inibizione notevole è osservata dopo quattro trattamenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La prova ha indicato che lncRNAs prendere parte nella regolazione di numerose procedure fisiologiche e patofisiologiche nei cancri, compreso MM7,8,9; Essi hanno il potenziale per essere mirati per il trattamento del cancro, che può essere realizzato da oligonucleotidi antisenso20,21,22. L’US Food and Drug Administration (FDA) ha approv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Lerner Research Institute proteomica, genomica e imaging core per la loro assistenza e supporto. Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da NIH/NCI grant R00 CA172292 (per J.J.Z.) e fondi di Start-up (a J.J.Z.) e la clinica e traslazionale Science Collaborative (CTSC) della Case Western Reserve University Core utilizzazione pilota Grant (a J.J.Z.). Questo lavoro utilizzata il microscopio confocale Leica SP8 che è stato acquistato con un finanziamento da istituti nazionali di salute SIG grant 1S10OD019972-01.
Materials
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT – 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC – 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG – 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG – 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
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