Estimation du nombre de néphron dans le rein entier à l’aide de la méthode de macération acide
Summary
Les estimations du nombre de néphron de rein entier sont importantes cliniquement et expérimentalement, car il y a une association inverse entre le nombre de néphron et un risque accru de maladie rénale et cardiovasculaire. Dans les présentes, l’utilisation de la méthode de macération acide, qui fournit des estimations rapides et fiables du nombre de néphron du rein entier, est démontrée.
Abstract
La dotation de néphron fait référence au nombre total de néphrons dont naît une personne, car la néphrogenèse chez l’homme est complétée par 36 semaines de gestation et aucun nouveau néphrons n’est formé après la naissance. Le nombre de néphron se rapporte au nombre total de néphrons mesurés à tout moment après la naissance. Les facteurs génétiques et environnementaux influencent à la fois la dotation en néphron et le nombre. Comprendre comment des gènes ou des facteurs spécifiques influencent le processus de la néphrogenèse et de la perte ou de la disparition de néphron est important car les individus ayant une dotation ou un nombre de néphron inférieur sont considérés comme étant à un risque plus élevé de développer une maladie rénale ou cardiovasculaire. Comprendre comment les expositions environnementales au cours de la vie d’une personne affectent le nombre de néphron sera également vital pour déterminer le risque futur de la maladie. Ainsi, la capacité d’évaluer le nombre de néphron de rein entier rapidement et de manière fiable est une exigence expérimentale de base pour mieux comprendre les mécanismes qui contribuent à ou favorisent la néphrogenèse ou la perte de néphron. Ici, nous décrivons la méthode de macération acide pour l’estimation du nombre de néphron de rein entier basé sur la procédure décrite par Damadian, Shawayri, et Bricker, avec de légères modifications. La méthode de macération acide fournit des estimations rapides et fiables du nombre de néphron (tel qu’évalué par le comptage des glomérules) qui sont à moins de 5% de ceux déterminés en utilisant des méthodes plus avancées, quoique coûteuses, telles que l’imagerie par résonance magnétique. En outre, la méthode de macération acide est une excellente méthode à haut débit pour évaluer le nombre de néphron dans un grand nombre d’échantillons ou de conditions expérimentales.
Introduction
Le néphron est à la fois la structure de base et l’unité fonctionnelle du rein1. Structurellement, le néphron se compose des glomérulus (capillaires et podocytes) situés à l’intérieur de la capsule du Bowman et du tubule rénal, composé du tubule proximale, de la boucle de Henle et du tubule distal qui se termine dans le canal collecteur. Fonctionnellement, le rôle du néphron est la filtration et la réabsorption de l’eau et des électrolytes et la sécrétion des déchets. En général, la néphrogenèse est achevée à 36 semaines de gestation chez l’homme et peu après la naissance chez plusieurs espèces comme la souris et le rat2. La dotation de néphron se rapporte au nombre total de néphrons avec lesquels un individu naît, alors que le nombre de néphron est le nombre total de néphrons mesurés à tout moment après la naissance3. Le nombre de néphron terme et le nombre glomérulaire sont souvent utilisés indifféremment. Comme il n’y a qu’un seul glomérulus par néphron, l’évaluation du nombre de glomérules est un substitut important pour estimer le nombre de néphron.
L’évaluation de la dotation en néphron et du nombre de néphron est d’intérêt clinique, car les études ont démontré une association entre la dotation en néphron et les nombres de néphron réduits avec une incidence accrue de maladies cardiovasculaires4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. sur la base des résultats obtenus dans les reins lors de l’autopsie, le Brenner a observé que les personnes hypertensives présentaient un nombre total inférieur de néphrons par rapport aux individus normotensifs16. Ainsi, Brenner a émis l’hypothèse qu’il existe une relation inverse entre le nombre de néphron et le risque de développer une hypertension plus tard dans la vie. Brenner a également émis l’hypothèse qu’une réduction du nombre de néphron était compensée par les néphrons qui restaient. Afin de maintenir le taux de filtration normal dans le rein, les néphrons résiduels compensent en augmentant leur surface glomérulaire (hypertrophie glomérulaire), ce qui permet d’atténuer tout effet indésirable de la perte de néphron sur la fonction rénale4 ,16.
Alors que la protection à court terme, l’hypertrophie glomérulaire, à long terme, conduit à une augmentation de la rétention de sodium et de liquide, augmentation du volume de liquide extracellulaire, et l’augmentation de la pression artérielle, conduisant à un cycle vicieux de nouvelles augmentations de pression capillaire glomérulaire, hyperfiltration glomérulaire, et cicatrices néphroniques (sclérose) et blessure4,16.
L’obtention d’estimations ou de dénombrements du nombre de néphron offre quelques avantages expérimentaux: 1) il fournit des informations sur le processus de néphrogenèse, qui peut ensuite être lié à des gènes ou des facteurs spécifiques dans l’embryon ou l’environnement maternel-fœtal, et 2) Il y a une association de nombre de néphron avec des maladies cardiovasculaires et, ainsi, il y a le potentiel que des estimations du nombre de néphron pourraient être employées pour prédire le risque cardiovasculaire futur2,17,18, le 19 , la vingtaine , le 21 , 22. en plus de l’environnement maternel-fœtal, plusieurs maladies affectent directement le nombre de néphron et la fonction rénale, y compris l’athérosclérose, le diabète, l’hypertension, et même le vieillissement normal2,9, 10,11,12,22,23. Ainsi, l’évaluation du nombre de néphron du rein entier est importante pour comprendre à la fois les facteurs génétiques et environnementaux qui affectent la néphrogenèse (c.-à-d., la dotation de néphron) et le nombre de néphron au cours de la vie d’une personne et les effets résultants sur la fonction rénale et la santé cardiovasculaire.
Actuellement, il existe plusieurs méthodes disponibles pour la détermination et la quantification du nombre de néphron, chacun avec ses propres avantages et limitations24,25,26,27,28 ,29,30. Les méthodes sophistiquées pour déterminer le nombre de néphron du rein entier comprennent des méthodes stéréologiques, telles que la méthode du dissecteur/fractionnement, et l’imagerie par résonance magnétique25,26. Souvent considéré comme l’étalon-or pour déterminer le nombre de néphron du rein entier, la méthode dissectorielle/fractionnatrice est à la fois coûteuse et chronophage. Les progrès récents et l’amélioration de l’imagerie et du traitement par résonance magnétique ont fourni les outils nécessaires pour compter chaque néphron individuellement. Cependant, l’imagerie par résonance magnétique n’est pas seulement chronophage mais aussi extrêmement coûteuse. En outre, la méthode dissectorielle/fractionnée et l’imagerie par résonance magnétique requièrent une expertise technique avancée, limitant ainsi l’utilisation de ces méthodes dans la majorité des laboratoires de recherche.
La plupart des méthodes de détermination du nombre de néphron font des dénombrements ou des estimations basés sur l’identification des glomérules, car ils sont facilement identifiables structurellement. Dans cet article, la méthode de macération acide pour estimer le nombre de néphron dans le rein entier est décrite et démontrée27. La méthode de macération acide est rapide, fiable et significativement moins coûteuse que d’autres méthodes, telles que la méthode dissectorielle/fractionnatrice et l’imagerie par résonance magnétique. En outre, la méthode de macération acide fournit des estimations hautement reproductibles du nombre de néphron qui ont été signalés comme étant dans la fourchette de ceux déterminés à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec une bonne technique expérimentale, la méthode de macération acide est idéale pour estimer le nombre de néphron dans le rein entier. Bien que le rein soit dissous dans l’acide, les glomérules demeurent largement intacts et sont facilement identifiables, rendant le comptage des glomérules individuels relativement facile et direct. La technique de macération acide est particulièrement avantageuse pour plusieurs raisons. Premièrement, la méthode de macération acide est une méthode rapide et pratique qui n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus en partie par les instituts nationaux de santé, National Heart, Lung et Blood Institute (R01HL107632).
Materials
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
Referências
- Hall, J. E., Guyton, A. C. . Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension?. American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other?. American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F. Molecular regulation of nephron endowment. American Journal of Physiology. 276 (4 Pt 2), F485-F497 (1999).
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Biologia do Desenvolvimento. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
