تحليل شبه الجينومية السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لإعداد عينات من الحمض النووي من المواد الغذائية والبيئية ميكروبيوميس لكشف متضافرة و subtyping السالمونيلا عن طريق التسلسل كواسيميتاجينوميك. الاستخدام المشترك لإثراء الثقافة والفصل إيمونوماجنيتيك (IMS) والتشرد متعددة يسمح التضخيم (MDA) فعالية تركيز الحمض النووي السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية.
Abstract
التسلسل ظاهرياً-ميتاجينوميكس يشير إلى تحليل على أساس التسلسل ميكروبيوميس المعدلة للغذاء والعينات البيئية. ويهدف تعديل ميكروبيومي في هذا البروتوكول، تركيز الحمض النووي من ملوث مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية المستهدفة تيسير الكشف عن و subtyping من مسببات المرض في سير عمل واحد. نشرح هنا، وإظهار خطوات إعداد نموذج لتحليل شبه ميتاجينوميكس انتيريكا السالمونيلا من التمثيل الغذائي والعينات البيئية بما في ذلك براعم البرسيم، فلفل أسود مطحون، الأرض لحوم البقر، الدجاج الثدي ومسحات البيئية. وتخضع عينات أولاً في إثراء الثقافة السالمونيلا لمدة أقصر وقابل للتعديل (ح 4 – 24). ثم بشكل انتقائي خلايا السالمونيلا يتم التقاطها من ثقافة الإثراء بفصل إيمونوماجنيتيك (IMS). وأخيراً، يتم التضخيم التشرد متعددة (MDA) لتضخيم الحمض النووي من الخلايا التي تم الاستيلاء عليها نظام الرصد الدولي. يمكن تسلسل إخراج الحمض النووي لهذا البروتوكول بمنصات تسلسل إنتاجية عالية. يمكن إجراء تحليل PCR كمي اختياري لاستبدال تسلسل للكشف عن السالمونيلا أو تقييم تركيز السالمونيلا الحمض النووي قبل التسلسل.
Introduction
نظرياً يسمح تسلسل Metagenomics كشف متضافرة و subtyping من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية. ومع ذلك، عينات المواد الغذائية تحديات لتحليل العوامل الممرضة حسب التسلسل مباشرة من ميكروبيومي الغذائية. أولاً، مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية غالباً ما تكون الحالي عند مستويات منخفضة في عينات المواد الغذائية. تتطلب معظم الأساليب المتاحة تجارياً الكشف السريع لا يزال ح 8 – 48 استزراع لإثراء الممرض الخلايا إلى مستوى الاكتشاف1. ثانيا، الكثير من الأطعمة تحتوي على خلايا النبت وفيرة و/أو الطعام الحمض النووي، مما يجعل DNA مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية نسبة ضئيلة من المواد الغذائية ميتاجينومي وهدفا بعيد المنال عن الكشف و subtyping مباشرة التسلسل الجينومية.
تم الإبلاغ عن تعديل للمواد الغذائية ميكروبيوميس السماح بتركيز كبير من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الحمض النووي لتسهيل الكشف على أساس تسلسل شيغا السمية المنتجة الإشريكيّة القولونية2،3 و انتيريكا السالمونيلا4. نظراً لأن تعديل المواد الغذائية ميكروبيوميس لا يزال مخاليط أنواع الميكروبية المختلفة، ويطلق على تسلسل شبه الجينومية تحليل4. يمكن إجراء تعديل ميكروبيومي بإثراء الثقافة وحدها2،3 ، أو في تركيبة مع فصل إيمونوماجنيتيك (IMS) ومتعددة التشرد التضخيم (MDA)4،5. يمكن التقاط نظام الرصد الدولي بشكل انتقائي خلايا الممرض من ثقافة الإثراء عن طريق الخرز المغناطيسي المغلفة بالأجسام المضادة. نجمة داود الحمراء يمكن أن تولد كميات كافية من الحمض النووي للتسلسل عن طريق بوليميراز الدنا ɸ29 ذات كفاءة عالية6. نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء أتاح كشف الممرض ثقافة مستقلة من7من العينات السريرية، وتقصير لإثراء الثقافة لكشف شبه الجينومية و subtyping السالمونيلا في الغذاء عينات4.
والهدف العام لهذا الأسلوب إعداد شبه ميتاجينوميك الحمض النووي من عينات الأغذية للسماح بتركيز المستهدفة السالمونيلا المجينية الحمض النووي والكشف عن اللاحقة و subtyping الملوث السالمونيلا بالتسلسل. مقارنة بالأساليب القياسية للكشف عن السالمونيلا 8،9 subtyping10، ونهج كواسيميتاجينوميك يمكن اختصار إلى حد كبير الزمنية اللازمة من الأغذية الملوثة، والعينات البيئية إلى الأنواع الفرعية الجزيئية لمسببات المرض بتوحيد البلدين عادة فصل التحليلات إلى سير عمل واحد. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص للتطبيقات مثل الاستجابة لمقتضيات الفاشية المنقولة وأخرى تتبع التحقيقات مرة أخرى حيث subtyping الممرض قوية مطلوب بالإضافة إلى الكشف عن العوامل الممرضة والتداول التحليلية السريع المهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
بسبب وفرة منخفضة كثيرا ومتجانسة في وجود السالمونيلا في الغذاء والعينات البيئية، إثراء الثقافة أمام جمعية نجمة داود الحمراء–نظام الرصد الدولي ما زال ضروريا للكشف عن السالمونيلا و subtyping؛ ولذلك خطوة حاسمة للبروتوكول. تحديد الشروط المثلى لزيادة الوفرة من السالمونيلا بالنسبة …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر مارك هاريسون وهيرش جوين من جامعة جورجيا لتقديم يرجى الضغط البكتيرية وغيرها من أشكال الدعم لهذه الدراسة.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Referências
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., & Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., & Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y. et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. (2017).
- Hyeon, J. Y., & Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63 111-116 (2017).
- Hosono, S. et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M. et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., & Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., & Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X. et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- Anonymous. Microbiology Laboratory Guidebook. <www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook> (2018).
- Andrews, W. H., Wang, H., Jacobson, A., & Hammack, T. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella., <www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm> (2018).
- Malorny, B. et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., & Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., & Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis S, P. J., Luo Y, Payne J, Shpuntoff A, Rand H, Strain E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20) (2015).
- Zhang, S. et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S. et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., & Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
